生驼乳中金黄色葡萄球菌的荧光PCR检测

文│韩涌（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心）

蔡扩军（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、新疆农业大学动物医学学院）

徐敏（新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、乌鲁木齐市奶业协会）

驼乳具有较高的营养价值和医学保健功能，近年来，驼乳需求量呈现“爆发式”增长，供不应求，价格一路攀升。与此同时，驼乳质量安全受到广大消费者的关注。金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病微生物，可造成严重的食物中毒，严重危害消费者的身体健康。生鲜牛乳中金黄色葡萄球菌污染报道较多，但驼乳中有关金黄色葡萄球菌的报道较少。为了解生鲜驼乳中金黄色葡萄球菌的污染状况，本研究使用荧光PCR方法快速检测生驼乳中的金黄色葡萄球菌，为预防和控制生驼乳中金黄色葡萄球菌引起的突发公共卫生事件提供技术支持。

一、材料与方法

1.主要试剂。7.5%氯化钠肉汤购自北京陆桥技术股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；金黄色葡萄球菌荧光PCR检测试剂盒购自深圳澳东检验检测科技有限公司。

2.主要仪器。荧光PCR（7500）仪器购自美国ABI；细菌培养箱，生物安全柜。

3.金黄色葡萄球菌的分离、检测。

（1）样品采集。采集生鲜驼奶90份，样品放入含有冰袋的运输箱内，低温运输至实验室。

（2）检验程序。

（3）操作步骤。增菌：按国家标准（GB/T 4789.10-2016）对生鲜驼乳进行前处理与增菌培养。无菌条件取25毫升驼奶样品放入三角瓶，再加入225毫升7.5%氯化钠肉汤，36±1℃培养18～24小时。

提取细菌基因组DNA：取增菌液1毫升加入EP管，10000转/分钟条件离心1分钟，弃上清，根据细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取增菌液中细菌基因组DNA。

反应组份配制：按照金黄色葡萄球菌荧光PCR检测试剂盒的说明书将样品DNA、核酸扩增反应液、金黄色葡萄球菌反应液、S-Taq酶加至反应管，反应总体积为25微升，同时设置阴性和阳性对照。

PCR扩增：将配置好反应液的反应管置于荧光PCR仪器中，扩增程序为预变性95℃ 3分钟、变性95℃ 5秒、退火/延伸60℃ 40秒，40个循环。

（4）结果描述及判定。阴性：无Ct值且无扩增曲线，表示样本阴性或被检测样本核酸浓度含量低于1×102副本/毫升。

阳性：Ct值≤30，且出现明显的指数增长期，表示样本阳性。

可疑：检测样本30＜Ct＜35时，重复一次。如果Ct值仍小于35，且曲线有明显的指数增长期，可报告样本阳性，否则报告样本阴性或者被检测样本核酸浓度含量低于1×102副本/毫升。

对照：阴阳性对照必须成立，否则此次实验视为无效。

二、结果

该试验阴阳性对照成立，本批次一共检测样品90份，其中11份阳性，阳性率11.1%。

三、讨论

金黄色葡萄球菌的检测方法包括传统的分离生化鉴定、免疫学检测、分子生物学检测方法等，本研究采用PCR方法结合荧光探针的扩增检测技术，操作简单，有效防止污染，能对样品中的金黄色葡萄球菌进行快速检测。由于直接从奶中提取细菌基因组DNA技术不成熟，提取出来的基因组DNA质量不高，常常影响后续的PCR扩增结果，因此在本研究中，首先对驼乳中的金黄色葡萄球菌进行增菌，再提取菌液中细菌基因组DNA，保证细菌DNA模板的质量，同时避免驼乳中金黄色葡萄球菌含量极低而出现假阴性。

本研究结果显示，生驼乳中金黄色葡萄球菌的污染率为11.1%，低于我国生牛乳中金黄色葡萄球菌的污染率，这可能与骆驼乳房炎患病率低于奶牛乳房炎有关。值得注意的是，本地人喜爱直接饮用发酵后的驼奶，而不像牛奶一样煮沸后饮用，因此，加强对驼乳中金黄色葡萄球菌的监测及快速检测具有重要的公共卫生学意义。