适宜施氮量对粗齿冷水花根际微域土壤磷组分及磷酸酶活性的影响

张明华，李金星，戴文颖，李廷轩，叶代桦*

（1 四川农业大学资源学院，四川成都 611130；2 四川省生态环境科学研究院，四川成都 610000；3 成都环境创新科技有限公司，四川成都 610000）

利用植物修复技术提取土壤过剩磷能有效防控磷流失，降低磷素非点源污染风险。然而，现有的磷富集植物普遍生物量小、磷积累量较低，对土壤过剩磷的提取能力有限[1]。研究表明，适宜施氮量能提高植物对磷的吸收积累能力，减少土壤对磷的固定[2–3]。施氮亦可显著提高狗牙草 (Cynodon dactylon)[1]、百喜草 (Paspalum natatum)[4]、水蓼 (Polygonum hydropiper)[5]等磷富集植物的生物量和磷含量，有效降低表层土壤过剩的磷。目前，关于施氮促进磷富集植物磷吸收积累能力的研究较多，但相关机理研究缺乏。

土壤磷组分可全面表征土壤磷素状况，磷组分之间的转化直接影响磷的有效性，根际土壤磷有效性高低对植物磷的吸收积累能力影响较大，H2OP和NaHCO3-P是植物有效性高的磷组分，NaOHP为中活性磷组分，而HCl-P和残渣态磷的植物有效性较低[6–7]。植物主要吸收利用土壤H2O-P和NaHCO3-Pi (Pi，无机磷)，对其他磷组分的利用能力较弱[7]。水稻在生长发育中根际土壤H2O-P和NaHCO3-Pi均有明显的亏缺现象[8]，油菜在生长后期根际土壤NaHCO3-Pi含量也明显降低[9]。施氮也能改变土壤磷的有效性，从而影响植物对磷的吸收效率[10–11]。土壤有机磷(Po)组分通常需矿化分解成有效性更高的磷组分才能被植物吸收利用。磷酸酶在土壤有机磷的矿化过程中扮演重要角色，其活性增加可促进土壤有机磷水解，为植物提供更多可利用性无机磷[12–14]。因此，研究植物根际土壤磷组分和土壤磷酸酶活性的变化，对明晰施氮促进磷富集植物提取土壤过剩磷具有重要意义。

前期研究发现，粗齿冷水花 (Pilea sinofasciata)具有良好的磷富集能力，且矿山生态型磷积累能力强于非矿山生态型；高磷800 mg/kg条件下，施氮140 mg/kg可显著提高矿山生态型粗齿冷水花磷积累量[15]，为适宜施氮量。然而，适宜施氮处理下，粗齿冷水花根际土壤磷组分及磷酸酶活性的变化特征及其与磷富集的关系尚不清楚。基于此，本研究以磷富集植物粗齿冷水花为研究对象，采用多隔层根箱土培试验，探讨适宜施氮处理下两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤磷组分和磷酸酶活性的变化，以期完善适宜施氮促进磷富集植物的富磷机理，为后期合理利用粗齿冷水花提取土壤过剩磷提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物：粗齿冷水花 (Pilea sinofasciata)，矿山生态型 (mining ecotype, ME)采自四川省什邡市磷矿区 (104°50′E, 30°25′N)，非矿山生态型 (non-mining ecotype, NME)采自雅安市雨城区 (102°59′E, 29°58′N)。

供试土壤为灰潮土，采自四川省都江堰市，基本理化性质：pH 7.4、有机质24.1 g/kg、全氮1.19 g/kg、碱解氮 42 mg/kg、有效磷 14.3 mg/kg、速效钾36 mg/kg。

供试肥料：尿素 (N 46.67%)、磷酸二氢钾 (P2O552.1%; K2O 34.6%)，均为分析纯。

1.2 试验设计与处理

试验设磷处理中磷质量浓度为P 800 mg/kg，氮处理中氮质量浓度为 N 0 (CK)和 140 mg/kg，每处理重复4次，共16盆，完全随机排列。采用自制多隔层根箱土培试验，根箱设计参照He等[16]和Li等[17]的方法并进行改良，如图1。该装置用黑色PVC板和孔径为25 μm尼龙网加工制成，大小为200 mm×150 mm×200 mm (长×宽×高)，由 1 个根室、10 个微域和2个土壤室组成，根室、微域和土壤室分别宽30、2和75 mm。土壤风干压碎后过筛，将磷源配成溶液一次性施入土壤，充分混匀，陈化8周，幼苗移栽前3天将尿素配成溶液施入土壤，混匀后装入根箱，每箱装土6 kg，供植株生长的根室装土1 kg，其余均匀分装到各微域和土壤室。

图1 多隔层根箱示意图Fig.1 Schematic representation of the multiple compartments rhizobox

粗齿冷水花幼苗的扦插管理采用刘霜等[18]的方法，待幼苗生长40天后，选择长势相对一致的幼苗移栽至根箱根室中，每盆种两株。采用自然光照，每周浇水2～3次，湿度保持田间持水量的70%。试验在四川农业大学教学科研园区有防雨设施的网室中进行。

1.3 样品采集与制备

于移栽后9周采集样品，将植株从根室中轻轻移出，采用抖根分离法收集附着于根系表面的土壤作为根际土壤 (R0)。植物样品先用自来水冲洗干净再用蒸馏水润洗，洗净后用吸水纸擦干，分为地上部和地下部后装袋，于105℃条件下杀青30 min，75℃烘干至恒重，粉碎后用于磷含量测定。根际微域土壤样品由近到远依次采集距根室 0—2 mm (R0–2)、2—4 mm (R2–4)、4—6 mm (R4–6)、6—8 mm (R6–8)和8—10 mm (R8–10)的土壤，将相同微域土壤混匀作为1个混合样；然后将2个土壤室中距根室较远的土壤混匀，收集小部分作为非根际土壤 (Bs)。一部分土壤样品自然风干，用于土壤磷组分测定；另一部分保存于–20℃冰箱，用于土壤磷酸酶活性测定。

1.4 测定项目及方法

植株磷含量采用HNO3微波消解—钒钼黄比色法测定[19]；土壤基本理化性质采用常规分析方法测定[19]；土壤有效磷含量采用 0.5 mol/L NaHCO3(pH 8.5)溶液浸提后钼锑抗比色法测定[19]；土壤速效钾含量采用1 mol/L醋酸铵浸提后用火焰光度计测定[19]；土壤磷组分采用改进后的Hedley等[20]和Tiessen等[21]的方法测定；土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性采用微孔板荧光法测定[22]；土壤植酸酶活性参考Ramesh等[23]的方法测定。

1.5 数据处理

采用SPSS (27.0)进行统计分析，选择LSD法进行多重比较，用 Excel (2013)和 Origin (8.0)进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 高磷条件下适宜施氮量对粗齿冷水花生物量、磷含量和磷积累量的影响

由表1可知，适宜施氮量下两种生态型粗齿冷水花地上部、地下部生物量和磷积累量均显著高于对照，其中矿山生态型地上部、地下部生物量分别较对照增加56.88%和86.04%，磷积累量分别较对照增加72.36%和90.54%；非矿山生态型地上部、地下部生物量分别较对照增加76.09%和68.75%，磷积累量分别较对照增加78.82%和68.85%。矿山生态型生物量和磷积累量显著高于非矿山生态型，其地上部和地下部生物量分别为非矿山生态型的1.28和1.78倍，磷积累量分别为非矿山生态型的1.45和1.71倍。不施氮与适宜施氮处理下，两种生态型地上部和地下部磷含量变幅较小，分别介于5.48～6.29和6.78～7.33 g/kg。表明高磷条件下适宜施氮量促进了粗齿冷水花生长和磷富集，尤其是矿山生态型。

表1 施氮对两种生态型粗齿冷水花生物量、磷含量和磷积累量的影响Table 1 Effects of N application on biomass, P concentration and P accumulation of two ecotypes of P.sinofasciata

2.2 高磷条件下适宜施氮对粗齿冷水花根际微域土壤磷组分的影响

2.2.1 水提取态磷 土壤H2O-P有效性较高，极易被植物吸收利用，其含量变化如图2。不施氮和适宜施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤H2O-P含量均随着距根室距离的增加先逐渐降低后趋于稳定。与不施氮相比，适宜施氮可增加两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤H2O-P含量，且H2OP在距根际4 mm微域内富集，其含量均显著高于非根际土壤。

图2 两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤H2O-P含量的变化Fig.2 Changes in concentrations of H2O-P in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.2.2 碳酸氢钠提取态磷 由图3可知，随着距根室距离增加，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤NaHCO3-Pi含量先降低后趋于稳定，NaHCO3-Po含量则逐渐增加。与不施氮相比，适宜施氮增加了两种生态型粗齿冷水花根际土壤NaHCO3-Pi含量，而NaHCO3-Po含量降低。适宜施氮处理下，矿山生态型和非矿山生态型根际微域土壤NaHCO3-Pi含量分别在距根际4和2 mm微域内显著高于非根际土壤，NaHCO3-Po含量分别在距根际6和8 mm微域内显著低于非根际土壤。不施氮和适宜施氮处理下，矿山生态型根际土壤NaHCO3-Pi含量显著低于非矿山生态型，分别为非矿山生态型的85.12%和85.27%，而NaHCO3-Po含量在两种生态型之间无显著差异，表明矿山生态型对根际土壤NaHCO3-Pi利用能力更强。

图3 两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤 NaHCO3-Pi和 NaHCO3-Po含量的变化Fig.3 Changes in concentrations of NaHCO3-Pi and NaHCO3-Po in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata.

2.2.3 氢氧化钠提取态磷 由图4可知，随着距根室距离增加，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量逐渐增加，但适宜施氮对根际土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量无明显影响。适宜施氮处理下，矿山生态型和非矿山生态型根际微域土壤NaOH-Pi含量分别在距根际6和8 mm微域内显著低于非根际土壤；根际微域土壤NaOH-Po含量均在距根际6 mm微域内显著低于非根际土壤。不施氮和适宜施氮处理下，根际微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量在两种生态型间均无显著差异。

图4 两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量的变化Fig.4 Changes in concentrations of NaOH-Pi and NaOH-Po in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.2.4 盐酸提取态磷和残渣态磷 由表2可知，不施氮与适宜施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤HCl-Pi、HCl-Po和Residual-P相对稳定，其中HCl-Pi、HCl-Po含量无明显变化，而矿山生态型根际土壤Residual-P含量在适宜施氮处理下显著低于非根际土壤。

表2 两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤HCl-P和Residual-P含量的变化Table 2 Changes in concentrations of HCl-P and Residual-P in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.3 高磷条件下适宜施氮对粗齿冷水花根际微域土壤磷酸酶活性的影响

2.3.1 土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶 由图5可知，随着距根室距离的增加，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均呈现下降趋势。与不施氮相比，适宜施氮增加了两种生态型粗齿冷水花根际土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性，矿山生态型根际微域土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性分别在距根际6和2 mm微域内显著高于非根际土壤；非矿山生态型根际微域土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性均在距根际4 mm微域内显著高于非根际土壤。适宜施氮处理下，矿山生态型根际土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性分别为不施氮处理的1.15和1.33倍；非矿山生态型根际土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性分别为不施氮处理的1.18和1.33倍。

图5 两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性变化Fig.5 Changes in activities of acid phosphatase and alkaline phosphatase in rhizosphere microdomain soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.3.2 土壤植酸酶 由图6可知，不施氮与适宜施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤植酸酶活性随着距根室距离增加均呈现下降趋势，在距根际8 mm微域内土壤植酸酶活性显著高于非根际土壤。适宜施氮处理下，两种生态型粗齿冷水花各微域土壤植酸酶活性均高于不施氮处理，距根际4—10 mm微域内矿山生态型土壤植酸酶活性显著高于非矿山生态型。适宜施氮增加了两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤的植酸酶活性，矿山生态型根际微域土壤植酸酶活性更高。

图6 两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤植酸酶活性变化Fig.6 Changes in activities of phytase in rhizosphere microdomain soilof two ecotypes of P.sinofasciata

3 讨论

3.1 适宜施氮对粗齿冷水花根际微域土壤磷组分的影响

植物对土壤过剩磷的修复效果取决于植物地上部的磷积累量，也受植株根际土壤磷有效性的影响，根际土壤磷组分变化反映了植物对土壤磷的利用情况[7]。本研究采用修订的化学连续浸提法测定土壤磷组分，将土壤磷组分根据化学浸提剂的不同分为5大类[20–21]，其中 H2O-P植物有效性最高，能被植物直接吸收利用；NaHCO3-P有效性较高，其中NaHCO3-Pi通常吸附在土壤表面容易被根系获取，NaHCO3-Po主要是活性较高且易被矿化分解的有机磷。土壤中H2O-P和NaHCO3-Pi含量与植物的生长和磷含量呈正相关关系，其含量的多少直接影响着植物对磷素的吸收能力[24]。白羽扇豆[25]、水稻[8]和蚕豆[26]对土壤H2O-Pi和NaHCO3-Pi具有较好的吸收利用能力，其根际土壤H2O-Pi和NaHCO3-Pi含量显著低于非根际土壤，大麦根表也出现了H2OP和NaHCO3-Pi的损耗[27]。然而，本研究中高磷条件下适宜施氮却增加了粗齿冷水花距根际4 mm微域内土壤H2O-P和NaHCO3-Pi含量，且显著高于非根际土壤，根际并未出现亏缺现象，这可能是在高磷条件下施氮时粗齿冷水花对H2O-P 和NaHCO3-Pi的吸收量低于其他磷组分转化为 H2O-P和NaHCO3-Pi的总量，因此出现根际富集现象。另外本研究中两种生态型根际土壤NaHCO3-Po矿化水解程度剧烈，其含量降低，距根际6 mm微域内土壤NaHCO3-Po含量显著低于非根际土壤 (图3)，这可能与根系分泌物有关。施氮可通过增加植物根系分泌物含量，使根系周围土壤生物化学特性不同于非根际土壤[28]，有助于根际土壤有机磷的矿化分解，分解后的土壤有机磷补充了H2O-P和NaHCO3-Pi的含量。研究发现，在高磷条件下增施氮肥可以增加植物的生物量，亦能提高植物对磷的吸收积累能力[1,5]。本研究中，高磷条件下适宜施氮使得两种生态型粗齿冷水花生物量和磷积累量均显著高于不施氮处理，这与前人研究结果相似，说明高磷条件下适宜施氮也能提高粗齿冷水花对土壤中磷的提取能力。此外本研究中适宜施氮处理下矿山生态型根际土壤NaHCO3-Pi含量显著低于非矿山生态型，矿山生态型地上部生物量和磷积累量显著高于非矿山生态型 (表1)，这可能是两种生态型对土壤NaHCO3-Pi的获取能力不同所致。

土壤NaOH-P属中等活性磷组分，是植物可利用的潜在磷源。松树根表5 mm范围内土壤NaOHP含量显著降低[29]；不同基因型玉米根表3 mm内NaOH-P含量明显降低[30]；施氮也能影响土壤NaOH-P含量，Fan等[31]向米槠 (Castanopsis carlesii)天然林土壤中添加氮后，发现表层土壤NaOH-Pi和NaOHPo含量降低。本研究中，适宜施氮处理下两种生态型根际微域土壤NaOH-Pi和NaOH-Po含量均在距根际6 mm微域内显著低于非根际土壤。可能是在高磷条件下适宜施氮时粗齿冷水花根际6 mm微域内土壤受根系分泌物和根际微生物影响较大，磷的矿化分解程度旺盛，导致土壤NaOH-P向有效性更高的磷形态发生了转化。与土壤中Ca或Mg氧化物结合的HCl-P较稳定，有效性较差，Residual-P主要是硅酸盐矿物磷和稳定性较高的有机磷，难以被植物吸收利用[32]。野生大麦根际HCl-P含量低于非根际土壤，可能是根系分泌的质子流出增加了土壤中与Ca或Mg氧化物结合磷的溶解度，从而降低了HCl-P含量[27,33]。然而本研究中两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤HCl-Pi和HCl-Po含量较稳定，适宜施氮处理下无显著变化，具体原因还有待进一步分析；而矿山生态型根际土壤Residual-P含量在适宜施氮处理下显著低于非根际土壤，可能是在适宜施氮处理下其根际存在Residual-P向其它磷组分的转化，导致其含量减少，表明矿山生态型在适宜施氮时对根际微域土壤磷的矿化能力较强。

3.2 适宜施氮对粗齿冷水花根际微域土壤磷酸酶活性的影响

土壤磷酸酶在调控土壤磷形态方面有着重要的作用，其活性的高低直接影响着土壤有机磷的分解转化及其生物有效性[34–35]。土壤酶活性大小与土壤肥力密切相关，施肥增加土壤养分含量而导致土壤酶活性增强[36–38]。研究发现合理增施氮肥后，毛竹(Phyllostachys heterocycla)土壤酸性磷酸单酯酶活性增加[39]，老芒麦 (Elymus sibiricusL.)根际土壤碱性磷酸酶活性能提高57.30%[40]，另外氮磷同时添加会显著提高华北落叶松人工林地土壤的土壤磷酸酶活性[41]，在高磷水平下油菜根际土壤酸性磷酸酶活性显著高于低磷水平下[9]，本研究中，适宜施氮处理下两种生态型粗齿冷水花根际与非根际土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶活性和植酸酶活性与不施氮相比均有所增加，可能是外源施氮可刺激微生物将过量的氮分配给磷酸酶，从而提高土壤磷酸酶活性[42]。松树根表5 mm范围内酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性显著高于非根际土壤[29]，油菜和大麦在根表3和4 mm范围内土壤酸性磷酸酶活性更高[9]。本研究中，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶活性分别在距根际4、2和8 mm微域内显著高于非根际土壤，可较好的解释粗齿冷水花根际6 mm微域内土壤NaHCO3-Po和NaOH-Po组分的减少 (图3，图4)。此外，结合表3可知，适宜施氮处理下，根际微域土壤H2O-P含量与3种酶活性均呈极显著正相关 (P<0.01)；NaHCO3-Pi含量与酸性磷酸酶和植酸酶活性呈极显著或显著正相关；NaHCO3-Po和NaOH-Po含量与磷酸酶活性均呈极显著或显著负相关。表明磷酸酶活性的升高和粗齿冷水花根际微域土壤有机磷的矿化过程具有密切的联系，根际微域土壤磷酸酶活性的升高能促进有效性较高的磷组分增加。矿山生态型粗齿冷水花根际土壤有更高的磷酸酶活性，有利于根际土壤有机磷的矿化，可能是矿山生态型磷积累能力优于非矿山生态型的原因之一。

表3 适宜施氮处理下粗齿冷水花根际微域土壤磷组分与酶活性的相关性Table 3 Correlation between phosphorus fractions and enzyme activities in rhizosphere soil of P.sinofasciata under suitable nitrogen application

4 结论

高磷条件下，适宜施氮可使有效性较高的H2O-P和NaHCO3-Pi在距两种生态型粗齿冷水花根际4和2 mm微域内富集，同时可分解利用距根际6 mm微域内的土壤NaHCO3-Po 和NaOH-P；适宜施氮量下，两种生态型粗齿冷水花根际微域土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和植酸酶活性分别在距根际4、2和8 mm微域内显著高于非根际土壤，更有利于根际土壤有机磷的矿化。与非矿山生态型相比，矿山生态型根际土壤磷酸酶活性更高，且对根际土壤中NaHCO3-Pi有更强的获取能力，是其在适宜施氮处理下磷积累能力更强的重要原因。