宫颈病变组织中高危型乳头瘤病毒感染及SLC5A8、RASSF2A基因启动子甲基化阳性率

况 漫 朱贵娟 马亚琳

湖北省十堰市人民医院(442000)

宫颈上皮内病变是宫颈浸润癌前病变，与其发生发展密切相关[1]。宫颈病变发展至宫颈癌前及时发现并给予有效干预具有重要意义[2-3]。人乳头瘤病毒(HPV)可引发不同性质的肿瘤[4]。SLC5A8基因是2002年被发现，近些年研究认为其表达在肿瘤发生中意义重要[5]。RASSF2A基因是RAS相关结构域家族基因2的A转录本，是潜在肿瘤抑制基因，与多种肿瘤的发生有密切关系[6]。本研究对宫颈病患者临床资料进行分析，探究高危型HPV感染及SLC5A8、RASSF2A基因启动子甲基化在宫颈病变诊断中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集2018年5月-2021年5月本院收治的宫颈病变患者186例临床资料，年龄(48.0±5.3)岁(26～61岁)。纳入标准：①符合《宫颈病变的诊断与治疗》[7]中宫颈病变诊断标准；②初次接受治疗；③未合并其他恶性肿瘤。排除标准：①已接收放射或化疗药物治疗；②妊娠期；③资料不完整。根据阴道镜宫颈活检病理诊断结果，分为宫颈上皮内瘤变I级组(73例)、II级组(57例)、III级组(56例)，正常细胞为对照组(43例)。本研究经院伦理委员会审批。

1.2 宫颈细胞检测

1.2.1HBVDNA采用北京英硕力金柏科技有限公司的HBV DNA检测试剂盒，PCR扩增法检测。先将89μl扩增混合液与1μlTAQ酶配置PCR反应体系(100μl)。按照标记向每个PCR管内加入10μl对应的样本DNA或阳性对照控品。混匀，离心后收集。将已配备完成的PCR扩增体系加入适宜的PCR扩增仪内：50℃ 2min，64℃ 4min，94℃ 30s；48℃ 45s，72℃ 20s，重复28个周期；随后94℃ 30s，65℃ 45s，72℃ 20s，重复25个周期。随后4℃下完成反应。将扩增产物处理后在仪器检测，探针信号值≥40m阳性，<40m阴性。

1.2.2SLC5A8基因启动子采用上海英潍捷贸易有限公司的SLC5A8检测试剂盒，甲基化特异性PCR法检测。按照说明书提取样本DNA并修饰，SLC5A8甲基化上游引物为5'-TCGAACGTATTTCGAGGC-3'，下游引物为5'-ACAACGAATCGATTTTCCG-3'；将对应的引物进行亚硫酸氢盐修饰DNA样本扩增：PCR在50℃ 2min，95℃ 2min；95℃ 15s；60℃ 30s，循环40次，对反应产物开始凝脂糖凝胶电泳。

1.2.3RASSF2A基因启动子甲基化采用北京天根生化科技公司试剂盒，按照DNA提取试剂盒说明书提取检测。收集1μgDNA溶于50μl水内，加入3mol/LNAOH溶液3.3μl，37℃下孵育15min；加入10mmolL氢醌 30μl以及520μl的亚硫酸氢钠混匀，50℃水浴16h。经过碱基修饰后的DNA进行脱盐、纯化和回收。修饰后DNA开始聚合酶链反应，甲基特异性引物：5'-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3'以及5'-AAAAACCAACGAC-CCCCGCG-3'，扩增的片段为108bp，反应体积30μl，在95℃下预变性5min，在95℃下变性30s，58℃退火30℃，72℃延伸30s。连续35个周期，在72℃下再次延伸6min，PCR产物通过琼脂糖电泳，在溴化乙锭染色后在凝胶成像系统下观察。

1.3 观察指标

检测各组标本HPV DNA、SLC5A8以及RASSF2A基因启动子甲基化阳性率。

1.4 方法

2 结果

2.1 各组标本HPV DNA阳性率对比

HPV DNA阳性率，对照组(0,0/43)、宫颈上皮内瘤变Ⅰ级组(28.8%,21/73)、Ⅱ级组(63.2%,36/57)、Ⅲ级组(92.9%,52/56)依次升高(χ2=54.358，P<0.001)。

2.2 各组标本SLC5A8基因启动子甲基化阳性率对比

对照组、Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组标本SLC5A8基因启动子甲基化及RASSF2A基因启动子甲基化阳性率均依次升高(均P<0.05)。见表1。

表1 各组基因启动子甲基化阳性率对比[例(%)]

3 讨论

宫颈病变为多重原因造成的宫颈部位发生病理性变化，包括感染、病原体入侵等引起的宫颈炎、宫颈肿瘤等[7-8]。导致宫颈病变的因素多种，病情程度可分为轻、中、重度，治疗不及时可能发展为宫颈癌，所以宫颈病变早期筛查与诊断极为重要[9-10]。

HPV是导致宫颈病变的危险因素，高危型HPV感染与宫颈癌的发生关系密切[11]。本研究结果显示，与对照组相比，子宫上皮内瘤病变I级、II级、III级组标本HPV DNA阳性率逐渐升高。SLC5A8基因是一种肿瘤抑制基因，该基因编码蛋白是一种细胞运载体，对乳酸、烟酸以及脂肪酸等进行转运，同时能对碘化物进行转运[12]。SLC5A8基因能够把丁酸运转到细胞内，且能发挥组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的功能，在上皮细胞癌前病变中发挥重要作用，可促进肿瘤细胞的凋亡[13]。本研究结果显示，对照组、子宫上皮内瘤病变I级、II级、III级组标本SLC5A8基因启动子甲基化阳性率逐渐升高，说明SLC5A8基因启动子甲基化与宫颈病变发生发展有一定关系。RASSF2A基因在人体脑、胎盘以及血液中较高表达，含有多种转录本，同时启动子区域含有多种CpG岛，能够促进转录的甲基化[14-15]。本研究结果显示，对照组、子宫上皮内瘤病变I级、II级、III级组标本SLC5A8基因启动子甲基化阳性率逐渐升高。可能因为：RASSF2A基因可以激活caspase3引起细胞的凋亡，且能导致细胞周期阻滞在G1期，抑制上皮细胞瘤的增生[16]。

本次研究通过检测不同病变程度患者标本中高危型HPV感染及SLC5A8、RASSF2A基因启动子甲基化阳性表达率存在差异，提示上述检测指标在宫颈病变中可能发挥重要作用，为临床防治提供思路。