THADA基因多态性及外周血FFA、irisin与多囊卵巢综合征发病风险的相关性

董延华 樊 荣

郑州大学第三附属医院(450000)

多卵巢综合征(PCOS)是女性常见的高度异质性内分泌紊乱性疾病，是不孕主要病因。随着病情进展，出现胰岛素抵抗(IR)、高血脂症等代谢紊乱性表现[1-2]。遗传因素在疾病的发病机制中起着至关重要作用[3]。THADA是PCOS易感基因，其SNP位点rs13429458可能通过抑制胰岛素调节血糖，与IR关系密切，而IR是PCOS发生发展的病理生理基础[4]。此外，与IR及血糖代谢相关的生化指标可能与PCOS也存在密切联系。外周血游离脂肪酸(FFA)及irsin均与IR及血糖代谢关系密切。FFA在正常人体内含量不高，能通过多种途径阻碍胰岛素的生理作用，参与IR[5]。irisin细胞因子是Ⅲ型纤连蛋白水解酶水解后被释放到循环系统内的多肽片段，外源性给予irisin能有效增加动物能量消耗，改善糖尿病模型大鼠的糖耐受情况[6]。有研究证实[7]，应用二甲双胍能有效提高T2DM患者irisin水平，减轻机体氧化应激反应。但目前，关于THADA基因多态性及外周血FFA、irsin与PCOS之间的关系尚不明确，为此开展本研究。

1 对象与方法

1.1 研究对象

将本院2018年1月-2021年1月收治的PCOS患者112例纳为观察组，80例因男方因素不孕的同龄妇女纳为正常组。纳入标准：①PCOS符合中国诊疗指南中相关诊断标准[8]；②对照组月经规律、排卵正常；③汉族，年龄21～35岁。排除标准：合并急慢性疾病、参与研究前3个月内创伤史、合并恶性肿瘤以及免疫性疾病史、近3个月内服用激素、降糖及降脂类药物。本研究经医院伦理委员会批准，参与者均知情且同意。

1.2 THADA基因多态性检测

采集被纳入对象外周血，-80℃保存待用。4℃解溶，在EDTA抗凝管中分装，按照外周血基因组DNA试剂盒相关说明提取外周血基因组DNA。DNA鉴定：核酸蛋白定量仪分别在260nm、280nm处吸光度值，计算吸光度比值估算核酸纯度，基因组DNA样本中吸光度比值>1.8即合格。含溴乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳，以DL2000 DNA Marker作为标记，电泳参数：120V恒压电泳30min，电泳完毕后使用凝胶成像仪观察并保存。引物序列：在Gene bank中寻找rs13429458序列，根据Primer 5.0软件设计引物序列，上海生工生物工程技术有限公司合成，rs13429458上游引物：5’-CAAGTCTTGGTCACAATCCAGGG-3’，下游引物：5’-CAAR ARARRCCAAATGAATGCACAATGGAGA-3’，大小为248 bp，退火温度55℃。PCR扩增实验：取0.6μl基因组DNA作为模板，采用rs13405728的特异性引物PCR扩增，反应体系总体积30μl，包括10×Pfu Buffer 3 μl，dNTP Mix(10 mM)0.6 μl，模板0.6 μl，Pfu Polymerase(2.5 U/μl)0.3 μl，ddH2O 24.3 μl。PCR反应程序：预变性95℃ 5min，变性95℃30s，退火60℃ 30s，延伸72℃ 30s，总延伸72℃ 7min，35个循环。含溴乙锭的1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件同上。酶切检测：rs13405728位点的限制性内切酶为H py 188Ⅲ，配置25μl酶切体系，包括10×NE Buffer、PCR产物以及水。将配置好的酶切体系置于PCR仪，37℃反应6min，65℃ 20min，酶切产物用含溴乙锭的3%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件同上。

1.3 外周循环血FFA以及irisin检测

采集纳入对象空腹外周静脉血离心分离血清，采用酶联免疫吸附法检测血清FFA、irisin水平，试剂盒购均购自美国BPB公司，FFA批内CV% 3.59～7%、批间CV%<5.2～8.1%，irisin批内CV% 4.3～8.2%、批间CV%<5.5～7.8%。

1.4 糖耐受试验及胰岛素抵抗

FPG及FINS水平检测分别采用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)以及胰岛素释放试验(IRT)检验，计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG(mmol/L)×FINS(mIU/L)/22.5。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 THADA基因多态性发生频率比较

Hardy-Weinberg平衡试验结果提示，观察组及正常组患者THADA基因SNP位点rs13429458型基因型频率分布的实际值与理论值均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，说明吻合度检验较好(P>0.05)，所纳入的研究群体具有代表性。

2.2 rs13429458基因型及等位基因分布频率比较

rs134294858基因型分布及等位基因频率观察组与正常组有差异(P<0.05)。见表1。

表1 两组rs13429458基因型及等位基因分布频率比较[例(%)]

2.3 PCOS患者rs13429458基因多态性与临床特征关系

比较发现，PCOS患者中，THADA基因 rs13429458位点TG+GG型与TT型患者多毛评分(FG)、黄体生成素(LH)/卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、睾酮(T)、孕酮(P)、甘油三酯、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平及腰臀比无差异(P>0.05)，而TG+GG型患者体质指数(BMI)及IR占比均高于TT型患者(P<0.05)。见表2。

表2 PCOS患者rs13429458基因多态性与临床特征关系分析

2.4 PCOS患者rs13429458基因多态性与血糖代谢关系

PCOS患者中，TG+GG型患者基因胰岛素0、30、60、120、180mIU/L，血糖30、60、120mmol/L以及HOMA-IR均高于TT型患者(P<0.05)，血糖0、180两种型患者无差异(P>0.05)。见表3。

表3 PCOS患者rs13429458基因多态性与血糖代谢关系分析

2.5 外周血FFA、irisin水平比较

观察组外周血FFA水平(0.63±0.16μmol/L)高于正常组(0.54±0.15μmol/L)，isin水平(153.14±36.45μg/L)低于正常组(218.47±33.74μg/L)(t=3.943、12.625，均P<0.001)。PCOS中存在IR患者外周血FFA水平(0.73±0.15μmol/L)高于非IR患者(0.56±0.13μmol/L)，irisin水平(136.49±22.44μg/L)低于非IR患者(164.74±23.79μg/L)(t=6.389、6.327，均P<0.001)，TG+GG基因型患者外周血FFA水平(0.72±0.16μmol/L)高于TT基因型患者(0.59±0.14μmol/L)，irisin水平(137.13±22.05μg/L)低于TT型患者(160.12±23.16μg/L)(t=4.324、4.900，均P<0.001)。

3 讨论

IR以及高胰岛素血症是PCOS及T2DM的共同病因，对于PCOS患者来讲，IR以及高胰岛素血症不仅是其糖代谢异常的基本特征，IR还可通过诱发高雄激素血症，并对卵泡发育及子宫内膜生长产生负面影响，进而导致PCOS生殖障碍[9-10]。PCOS与遗传因素密切相关，THADA是与 2号染色体p21位点关系最为密切的PCOS易感基因，本研究发现，PCOS患者THADA基因SNP位点rs13429458基因型与正常组相比差异明显，TG基因型明显多于正常组，等位基因G的频率高于正常组；PCOS患者THADA基因SNP位点rs13429458的TG+GG基因型患者胰岛素0、30、60、120、180、血糖30、60、120以及HOMA-IR、BMI水平均高于TT基因型患者，提示易感基因THADA SNP的突变可能通过影响糖代谢促进IR，参与PCOS的致病机制。

FFA是血清中未与甘油、胆固醇等脂化的脂肪酸，反映脂代谢紊乱灵敏度优于HDL、LDL以及甘油三酯；此外，FFA可通过影响葡萄糖代谢途径，促进前炎症调控因子转录、诱导内质网应激、激活炎性因子等方式，干扰胰岛素作用，导致葡萄糖无法正常代谢进而形成IR[11-12]。本研究发现，PCOS患者血清FFA水平高于正常组，且合并IR患者高于非合并NIR患者、THADA基因 SNP位点rs13429458 TG+GG基因型患者TT型患者，提示PCOS患者外周血FFA水平降低，且在合并IR者及THADA基因突变者中更为严重，分析认为THADA SNP突变还可能通过增加FFA含量促进IR。

irisin是近年来新发现的肌源性细胞因子，广泛分布于人体各个组织及器官，能诱导白色脂肪释放能量转化为棕色脂肪，进而增加耗能，减轻体重[13-14]。有动物实验表明[15]，给予外源性irisin能有效改善T2DM小鼠糖代谢及IR状况。本研究发现，与正常组相比，观察组血清irisin水平降低，且在合并IR以及THADA基因SNP位点rs13429458的TG+GG基因型患者中更明显。提示THADA基因突变还可能通过降低血清irisin水平，加重血糖代谢紊乱，促进IR。

受限于本研究设计及研究条件，本文未对THADA基因突变在增加外周血FFA水平、降低irisin水平，促进IR中的具体机制进行探究，可作为下一步研究方向。

综上所述，易感基因THADA SNP突变可能通过影响糖代谢，增加外周血FFA水平，降低irisin水平，共同促进IR，参与PCOS的致病机制。