三磷酸腺苷结合盒转运体a3基因外显子10多态性与新生儿呼吸窘迫综合征易感性的关系

王雪芹 杨晓宇

作者单位： 475000 河南开封 开封市儿童医院新生儿科

新生儿呼吸窘迫综合征(respiratory distress syndrome of newborn，NRDS)主要是因患儿肺发育不全、肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)缺乏等因素造成肺泡病理改变而引起[1]。PS缺乏可加重肺泡毛细血管内皮损伤，导致肺泡塌陷和肺液集聚，而诱发NRDS[2-3]。有研究[4-5]显示，基因遗传因素也是影响PS结构功能，引起PS代谢循环障碍，导致NRDS发病的重要因素。ATP结合盒转运子A3(ATP binding cassette transporter A3，ABCA3)是ATP结合盒转运子的亚科，可协助脂类跨膜转运而影响PS的合成。ABCA3基因外显子10位点位于α螺旋跨膜结构域，可利于不同底物结合、转运，该位点基因多态性可改变信使RNA稳定性，而影响扩膜结构域的完整性，导致脂质转运功能异常[6]。而目前对于该基因变异位点与NRDS的关系报道较少。故本研究通过分析新生儿ABCA3外显子10多态性与NRDS发生及进展的关系，旨在为探寻NRDS发病的分子遗传性机制及为该疾病的临床防治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取73例2020年1月至2022年2月开封市儿童医院住院/门诊诊疗的NRDS患儿为NRDS组，选取同期58例健康新生儿为对照组。两组研究对象性别、胎龄等一般资料对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 NRDS组与对照组的一般资料比较

1.2 纳入排除标准 纳入标准：①NRDS组对象均符合NRDS的诊断标准[7]，出生后数小时内出现呼吸急促，达60次/分以上，伴呼气性呻吟，吸气时三凹征，病情进行性加重，继而出现呼吸不规则、呼吸暂停、青紫、呼吸衰竭。体检两肺呼吸音减低，血气分析提示二氧化碳分压升高，氧分压下降等；②临床资料完整者；③单胎妊娠。排除标准：①败血症患儿；②合并严重先天性疾病患儿；③有胎粪吸入史者；④多胎妊娠；⑤肺气漏、先天性肺发育不良等肺部疾病患儿。本研究经伦理委员会审核批准(伦理审批号:2021KW037-12)。

1.3 方法

1.3.1 ABCA3外显子10多态性检测 采集NRDS组及对照组对象外周静脉血500 μL，应用血液基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物)提取总DNA，采用PCR法对所提取的DNA样本进行扩增，扩增引物由上海生工生物设计完成，应用Verity96well型PCR仪(美国ABI公司)进行检测，ABCA3基因外显子10rs13332514位点引物序列为SC745-F：5’-CTGTCAATGTCCCACTCCTCTC-3’，SC745-R：5’-TTCTCCCTAAATTACGCTGACTT-3’，扩增长度为413 bp。应用DYY-8C型电泳仪(北京六一仪器厂)，使用1%的琼脂糖电泳进行电泳处理。应用3730XL型测序仪(美国ABI公司)进行序列测定，测序结果与GenBank基因库正常序列进行比对判读。

1.3.2 肺表面活性物质表达 采集NRDS组患儿外周静脉血2 mL，在4℃环境下，应用上海医疗器械有限公司TGL-14G台式高速离心机以3 500 r/min的速率进行离心处理，离心半径为10 cm，离心时间为5 min。取上清液，应用ELISA双抗体夹心法检测患儿血清中肺表面活性相关蛋白A(pulmonary surfatcant-associated protein-A，SP-A)、肺表面活性相关蛋白B(pulmonary surfatcant-associated protein-B，SP-B)、肺表面活性相关蛋白C(pulmonary surfatcant-associated protein-C，SP-C)水平，试剂盒由武汉伊艾博科技有限公司提供。取患儿支气管灌洗液3 mL，单层无菌纱布过滤后以800 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，取上清液进行检测，以氨萘磺酸法测定患儿BALF中总磷脂(total phospholipids，TPL)水平，四氧化锇反应后中性铝粉柱层析法测定患儿BALF中饱和卵磷脂(saturated phosphatidylcholine，SatPC)水平；采用改良Folin酚试剂法测定患儿BALF中总蛋白(total protein，TP)水平。

1.4 观察指标比较 NRDS组及对照组ABCA3基因外显子10多态性差异。根据严重程度将NRDS组分为4级[7]，参照文献[8]，以Ⅰ、Ⅱ级为轻度组，Ⅲ、Ⅳ级为重度组，比较不同严重程度及不同胎龄患儿的ABCA3外显子10多态性差异。

2 结果

2.1 NRDS组及对照组ABCA3基因外显子10多态性的Hardy-Weinberg平衡分析 NRDS组及对照组ABCA3基因外显子10 rs13332514位点基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，两组该位点GG、GT、TT型实际频率与理论频数比较，差异均无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 NRDS组及对照组ABCA3基因外显子10多态性的Hardy-Weinberg平衡分析

2.2ABCA3基因外显子10多态性与NRDS发病的logistic回归分析 NRDS组ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT型检出率高于对照组，GG型检出率低于对照组(P<0.05)。进行logistic回归分析时，以研究对象是否出现NRDS为因变量(NRDS发病为1，无NRDS为0)，将ABCA3基因外显子10基因型(GG、GT、TT)作为自变量，采用似然法纳入logistic回归分析进行多因素分析，结果显示，ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT型为NRDS发生的危险因素，GG型为保护因素(P<0.05)。见表3、4。

表3 NRDS组及对照组ABCA3基因外显子10多态性比较[(例)%]

表4 ABCA3基因外显子10多态性与NRDS发病的logistic回归分析

2.3 不同NRDS严重程度患儿的ABCA3基因外显子10多态性比较 重度组ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT型检出率高于轻中度组，GG型检出率低于轻中度组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 不同NRDS严重程度患儿的ABCA3基因外显子10多态性比较[例(%)]

2.4 不同胎龄NRDS患儿的ABCA3基因外显子10多态性比较 早产儿及足月儿的ABCA3基因外显子10rs13332514位点GG、GT、TT型检出率对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表6。

表6 不同胎龄NRDS患儿的ABCA3基因外显子10多态性比较[例(%)]

2.5 不同ABCA3基因外显子10基因型患者的肺表面活性物质表达比较 不同基因型患儿SP-A、SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平对比，差异有统计学意义(P<0.05)；TT型患儿SP-A水平高于GT、GG型，SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平低于GT、GG型(P<0.05)；GT型SP-A水平高于GG型，SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP水平低于GG型(P<0.05)。见表7。

表7 不同ABCA3基因外显子10基因型患者的肺表面活性物质表达比较

3 讨论

NRDS主要是因PS缺乏造成的肺泡张力下降，肺泡扩张受限，患儿多表现为进行性加重的呼吸异常症状[9]。目前认为，基因突变引起PS合成分泌减少，是引起NRDS发生的重要因素[10]。ABCA3蛋白在脂质转运、维持PS中磷脂动态平衡及其合成有着极为重要的作用。有研究发现[11]，部分小鼠敲除ABCA3基因后可出现肺间质增厚现象，提示该基因突变或与肺疾病的发生有关。有学者发现[12-13]，ABCA3基因突变可导致肺间质疾病的发生，该基因突变可使幼儿表现为肺上皮细胞增生，年长儿出现肺小叶重构。本研究结果显示，NRDS组及对照组ABCA3基因外显子10rs13332514位点基因型符合Hardy-Weinberg平衡，表明纳入的研究对象中不存在近亲、化学环境等因素导致的突变率升高、迁移等,样本具有代表性。本研究结果显示，NRDS组ABCA3基因外显子10rs13332514位点GT、TT型检出率高于对照组，表明NRDS患者ABCA3基因外显子10基因突变率较高。经进一步分析发现，ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT型为NRDS发生的危险因素，GG型为保护因素，与张钰恒等[14]研究结果一致。其原因可能在于，ABCA3基因外显子10突变可引起肺泡内蛋白沉积，肺间质及胶原纤维增生，最终导致NRDS的发生[15]。

临床研究[16-17]显示，NRDS的发病率与胎龄有关，胎龄较小新生儿因肺部发育较差，PS产生较少，呼吸、储备功能较低，导致NRDS发病率较足月儿高。本研究发现，不同胎龄NRDS患儿该位点GG、GT、TT型检出率差异无统计学意义，提示ABCA3基因多态性或与胎龄无显著相关。本研究结果显示，重度NRDS患儿ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT型检出率较高，这主要是因为ABCA3基因可将磷脂等脂质转运至板层小体，影响PS的加工过程，进而影响患儿肺功能[18-19]。

国内外均有研究[20-23]显示，ABCA3蛋白在PS脂类转运过程中具重要的作用。SP是PS的主要活性成分，存在于支气管和肺泡表面气液界面，当肺部出现上皮组织损伤时，肺泡毛细血管屏障被破坏，肺微血管通透性增加，导致SP入血，使得其外周血水平升高[24]。本研究结果显示，ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT、GT型患儿的SP-A水平高于GG型，与相关研究[25-26]结果相符，这主要与ABCA3基因外显子10突变型患儿肺部损伤较严重有关。ABCA3基因突变可导致该蛋白分泌异常，而继发性影响SP的转录和表达过程[27-28]。但尚不知该基因外显子10突变是否与SP-B、SP-C表达相关。为此，本研究对不同ABCA3基因外显子10基因型患者的SP-B、SP-C表达情况进行分析，发现ABCA3基因外显子10rs13332514位点TT型患儿SP-B、SP-C、SatPC/TPL及SatPC/TP均较GT型和GG型低，提示该位点基因突变可影响SP-B、SP-C等蛋白表达，本研究认为，这或为该基因突变可增加NRDS易感性的重要原因。

综上所述，ABCA3基因外显子10基因TT型是NRDS发生的危险因素，并该基因多态性可影响患儿SP表达。本研究尚存在不足之处，纳入例数有限，可能导致研究结果出现偏倚，故具体机制还需进一步研究证实。