循环游离DNA在甲状腺癌诊疗中的应用

李宁，朱春悦，洪方成，冯哲明，郑玉鑫，张风华

（1.河北医科大学研究生学院，河北 石家庄 050051；2.河北省人民医院腺体外科，河北 石家庄 050051；3.华北理工大学研究生学院，河北 石家庄 050051）

甲状腺癌是最常见的内分泌癌类型，约占肿瘤总数的2%[1]。在过去的30年里，甲状腺癌发病率在全世界范围内呈上升趋势，在中国，甲状腺癌已跻升至女性恶性肿瘤的第3 位，且发病出现年轻化趋势，已成为我国30 岁以下女性增长最快的恶性肿瘤[2]。目前甲状腺癌诊断主要依靠甲状腺超声及细针穿刺（fine needle aspiration，FNA），但是由于肿瘤的异质性，使用FNA 评估的甲状腺结节中有15%～30%无法鉴别良恶性[3]。在甲状腺癌的复发检测方面，目前依赖于颈部的超声等影像学检查和连续的甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg）测量，然而Tg 具有器官特异度，但不具有肿瘤特异度，在有残留甲状腺组织的治愈患者中仍然可以检测到，同时部分患者体内存在甲状腺球蛋白抗体干扰Tg 水平的测量，这些因素都会对甲状腺癌复发的监测造成阻碍。循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA） 是肿瘤细胞通过坏死或凋亡过程释放的胞外核酸片段[4]，携带有肿瘤组织基因，作为液体活组织检查的主要组成部分cfDNA 检测技术显示了无创、快速、易于重复的优点，是肿瘤遗传和表观遗传学改变的实时代表[5]。近几年循环中高水平的cfDNA 被发现与癌症的诊断和进展有关，并显示出作为癌症反应生物标志物的潜在特征[6]，在癌症的诊治和预测转移等方面发挥作用。下面将围绕cfDNA 在甲状腺癌早期诊断、转移、预后等方面的应用展开阐述。

1 cfDNA在甲状腺癌早期诊断中的应用

cfDNA 已被证明在乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌等多种癌症的诊断中具有重要的临床应用价值[7-11]，在甲状腺癌中可通过评估cfDNA 的定量分析、完整性、突变基因及甲基化水平协助甲状腺癌的早期诊断[12]，这为甲状腺癌的早期诊断提供了一种新的检测指标。

1.1 cfDNA定量分析及完整性检测在甲状腺癌早期诊断中的应用

循环游离DNA 完整性（circulating free DNA integrity, cfDI）是指血浆或血清中较长的DNA 片段与较短片段的浓度之比。在细胞凋亡过程中，正常细胞会在血液中释放大约180～200 bp 小而均匀DNA 片段，而肿瘤细胞会释放出较长且不均匀的DNA 片段，导致癌症患者的cfDI 提高[13]。cfDI 已被证实在区分肝脏、乳腺以及肾脏结节良恶性方面发挥有效作用，成为癌症诊断和预后的一个有前途的生物标志物[14-16]。Salvianti 等[17]通过基于定量2 个不同长度的扩增子（分别为67 和180 bp） 来评估cfDI （180/67） 在甲状腺癌患者与良性甲状腺结节患者两者之间的差异，发现甲状腺癌患者较良性结节患者及健康人cfDI 更高，这一发现支持cfDI 可能成为甲状腺结节早期鉴别诊断的一个标志物。

绝大多数cfDNA 是由非肿瘤细胞释放的，由肿瘤细胞凋亡或坏死后释放的一小部分cfDNA 被称为循环肿瘤 DNA （circulation tumor DNA，ctDNA）[18]。 ctDNA 分为核DNA 和线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。近年来大部分研究都集中在核DNA，近年提出mtDNA 可区分良恶性肿瘤，也可能为癌症诊断和预后提供重要信息[19-20]。最近一项研究[21]使用定量荧光PCR 技术分析了甲状腺癌、结节性甲状腺肿患者和正常人血液中mtDNA 的水平，发现在甲状腺癌患者血浆中mtDNA 的完整性比值明显增高，但是甲状腺癌细胞释放完整mtDNA 的机制尚需要进一步研究。

此外，多项研究[17,21-24]通过对cfDNA 定量分析发现，甲状腺癌中cfDNA 浓度水平较甲状腺良性疾病及健康者明显增高，表明cfDNA 的定量分析可成为甲状腺癌早期诊断的潜在指标。对于细针穿刺结果性质不明的甲状腺结节，可通过cfDNA 定量检测进一步鉴别良恶性结节，诊断甲状腺恶性结节的敏感度为100%，特异度为92.3%[23]。亦可在常规参数如降钙素（calcitonin，CT）无法应用时，作为甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）的诊断指标[25]。

1.2 cfDNA基因突变分析在甲状腺癌早期诊断中的应用

有研究[22]对甲状腺癌患者、良性甲状腺疾病患者及健康者进行cfDNA 中特定基因的检测，对比结果发现，BRAFV600E 基线水平在甲状腺癌患者体内的百分比明显增高。Cradic 等[26]采集173 例甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）患者及20 例非PTC 患者血液行BRAFT1799A 检测，发现该基因突变在PTC 患者中检出率是11.6%，而在非PTC 患者的血液及石蜡包块样本中均为未发现该基因突变，由此可见BRAFT1799A 的检测可能在甲状腺癌诊断中发挥作用，但需进一步研究证实。

1.3 cfDNA基因甲基化水平检测在甲状腺癌早期诊断中的应用

除了cfDNA 基因突变外，血清DNA 甲基化评估作为一种新的甲状腺癌诊断工具于2006年被提出[27]。如TIMP3、DAPK 等肿瘤抑制基因启动子区域的异常甲基化使基因处于失活状态，进而导致甲状腺癌的发生[28]。目前关于甲状腺癌早期筛查常用的异常甲基化状态的基因有RASSF1[29]；Calca、CdH1、 TIMP3、 DAPK、 RARβ2[27]； SLC5A8、SLC26A4[30]。近几年提出甲基转移酶甲基化状态在甲状腺癌早期诊断中也发挥着重要作用，循环中DNA 甲基转移酶基因（MGMT 和DNMT1） 启动子区域甲基化状态在甲状腺癌的早期诊断中有较高的灵敏度及特异度[30]。

2 cfDNA在预测甲状腺癌转移中的应用

甲状腺癌切除术术前主要依靠影像学以及细针穿刺活检来评估甲状腺癌转移情况，然而有些转移灶单纯依靠术前影像学检测很难发现。cfDNA检测在预测局部晚期或转移性甲状腺癌中具有一定作用，可以弥补传统检测方法的不足。

PTC 中BRAFV600E 突变的全球发生率约为45%[31]，在中国更高达85%[32]。 在PTC 患者中BRAFV600E 的表达与预后不良相关[33]，建议对携带该基因突变的患者进行积极干预和规律随访，以防止肿瘤复发。研究[34-40]发现，血液循环中BRAFV600E 突变与甲状腺癌的腺体外侵犯、转移以及肿瘤较强的侵袭性有关。BRAFV600E 突变亦是甲状腺癌发生对侧淋巴结转移的一个重要危险因素，且与甲状腺癌较高侵袭性和转移性相关[41]。有研究[35]表明，NRAS 基因突变在cfDNA 中的敏感度为50.00%，特异度为98.18%，但其在肿瘤中的低频率限制了其独立应用，可采用NRAS 突变与血浆BRAFV600E 检测联合的方法监测甲状腺癌转移情况。

同样，cfDNA 基因甲基化状态在甲状腺癌转移方面也具有一定的预测功能，如：RAS 结合域家族蛋白1 （RASSF1） 和钠转运体编码基因（SLC5A5） 的甲基化水平与疾病侵袭性相关[42]；SLC5A8 基因通过促凋亡作用发挥抑癌功能，其甲基化状态已在不同的癌症中观察到[43]，SLC5A8 的高甲基化状态与甲状腺癌的分期、多灶性和腺体外侵犯呈正相关[44]。基于对PTC 患者血液中cfDNA定量检测分析发现，cfDNA 的高检出率与肿瘤大小、远处转移及侵袭性密切相关[45]。

3 cfDNA在预测甲状腺癌预后中的应用

ctDNA 在预测甲状腺癌预后中的效果明显优于其他影像学检测和蛋白标志物检测。多项研究表明cfDNA 中特定基因突变的检出率与甲状腺癌总生存率及不良预后有关， 如PIK3CA[46]、BRAFV600E[47-48]、RETM918T[49]。有研究[47,50]发现在转移性MTC 患者中RET 基因和BRAF 基因突变更为常见，可预测其不良预后。同时发现在分化型甲状腺癌（differentiated thyroid carcinoma，DTC）和间变型甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC） 患者中，循环中NRAS 和TP53 突变的高表达状态会增加肿瘤进展的可能性[47]。

目前对于甲状腺癌术后复发监测主要依靠影像学检查及常规生物学标志的检测，研究[47]发现通过cfDNA 检测技术可以更早发现常规影像学检测不到的微小残留病灶及复发迹象，可成为一种重要的补充检测方法。通过对甲状腺癌患者中持续疾病状态（persistent disease，PD） 及无疾病状态（no evidence of disease，NED） 两类患者血浆中的cfDNA 检测，发现在PD 患者中cfDNA 百分比明显高于NED 患者。与传统检测方法相比，cfDNA 在检测疾病状态和肿瘤负担方面具有更高的敏感度和特异度[45]。Patel 等[36]通过对甲状腺癌术前、术后血浆样本中BRAFV600E 基因突变表达丰度差异的检测来判断微小病灶残留及预测甲状腺癌术后复发。此外有研究[26,39,51]已证实BRAFT1799A 突变与PTC 的局部侵袭性、淋巴结转移和复发率有关，这说明BRAFT1799A 可能成为预测PTC 预后的潜在标记物。

4 cfDNA 在监测甲状腺癌治疗反应中的应用

当前甲状腺癌的治疗方式以手术和放疗为主，靶向治疗逐步应用于晚期放射性碘难治性甲状腺癌患者的治疗，提高其无进展生存期[52]。在治疗期间，cfDNA 液体活检技术可作为识别细胞分子特征的微创方法，帮助预测疾病进展、纵向监测肿瘤细胞对治疗药物的反应、提供个性化治疗[53]。而且，治疗期间总cfDNA 水平的变化在监测治疗反应及指导治疗方面的作用已在肝癌[54]、黑色素瘤[55]等多种癌症中得到证实。cfDNA 水平较传统标志物在反馈治疗反应及疾病状态变化方面具有更高的灵敏度[37]。通过检测循环中的BRAFV600E[22]和RETv804M[56]可筛选出可能导致治疗耐药的新突变基因，动态观察治疗反应，及时终止无效治疗，针对性指导药物选择。

Salviant 等[17]对17 例患者治疗前后血浆中cfDI水平进行对比，发现无论是否进行放射性治疗，治疗后的cfDI 均低于治疗前，这说明cfDI 检测可能在监测治疗方面发挥作用，但仍需要进一步的研究。

5 总结与展望

综上所述，cfDNA 检测技术除具有简单、无创等优点外，与传统标记物相比还具有更高的敏感度，已在甲状腺癌的早期诊断、微小残留病灶、预后及治疗反应监测中显示其独特的优势。但血液样本的选择、cfDNA 的检测方法等可能会导致cfDNA 检测灵敏度及敏感度降低，进而影响最终检测结果。因此，还需继续深入了解cfDNA 脱落机制以及开发更灵敏的检测方法并检验其在甲状腺癌的诊疗中的应用效果。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。