孕康口服液联合主动免疫治疗同种免疫型复发性流产疗效及机制探究

庄莉莉 孙 凯 聂翠翠 丁秀梅

阳光融和医院(潍坊，261041)

复发性流产(RSA)中仅20%～30%患者可获得再次妊娠成功[1]。RSA的发病机制复杂，主要认为与染色体异常、血栓前状态、感染、内分泌紊乱及免疫因素等有关，但40%～60%的RSA患者病因不明，为不明原因性复发性流产(URSA)。近年研究发现50%的URSA与同种免疫异常相关[2]。目前临床主张对同种免疫型URSA采取淋巴细胞主动免疫治疗(LIT)，以抑制母-胎界面免疫排斥反应而维持妊娠，但疗效仍然有限[3]。近年来，中西医结合治疗URSA获得了高度重视。有研究[4]显示，在西医调节母-胎免疫基础上联合中医药治疗能够改善西药治标不治本及不良反应多等问题，且可弥补单纯中医治疗周期长及起效慢等缺陷。本研究对同种免疫型URSA患者在淋巴细胞主动免疫治疗基础上，联合中成药孕康口服液治疗，观察其临床疗效并从免疫调节等方面初步揭示其作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年1月-2020年5月在本院妇产科就诊的同种免疫型URSA患者150例，随机数字表法按1:1比例分为观察组与对照组各75例。纳入标准：①符合同种免疫型RSA诊断标准[5]，经内分泌检查、免疫学检查等确诊，且距前次流产<12个月；②经封闭抗体检查呈阴性；③配偶精液检查正常；④在了解本次研究内容后自愿入组并签署知情同意书。排除标准：①有遗传性疾病、先天性生殖系统畸形；②抗子宫内膜抗体、抗心磷脂抗体、抗精子抗体等检查异常；③合并内分泌疾病、感染性疾病、血液系统疾病、妇科良恶性肿瘤、全身恶性肿瘤；④合并其他可能引起自然流产的疾病；⑤入组前3个月内接受免疫治疗或使用免疫功能调节类药物。本次研究获得医院伦理委员会审批。

1.2 治疗方法

两组均接受LIT治疗，即采集配偶或第三方健康供血者的外周静脉血20～30 ml，加入肝素及生理盐水各25 ml，以Ficoll密度梯度离心法分离获得淋巴白细胞(淋巴细胞分离液由天津TBD公司生产)。采用无菌生理盐水连续洗涤3次清除血小板，调整细胞浓度至2×107～4×107个/ml。常规消毒，经前臂内侧皮下注射淋巴细胞悬液，分为6～8点注射完，每点0.2～0.3 ml，各注射点间隔3 cm。每隔3周进行1次免疫治疗，直至妊娠12周末检查胎儿正常后停药。观察组再给予孕康口服液(回音必集团浙江亚东制药有限公司，10ml/支)口服，20 ml/次，3次/d，连续用药至妊娠12周末。

1.3 观察指标

1.3.1免疫指标测定治疗前后取患者晨空腹静脉血6.0 ml分2管，1管置于EDTA抗凝管中，加入淋巴分离液后以Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PMBC)悬液，采用流式细胞分析仪(美国安捷伦)检测辅助性T细胞(Th)1、Th2、Th17和Treg细胞，Treg细胞以CD4+CD25+FoxP3+定义；另3.0ml置于分离胶促凝管中，3000 r/min离心分离血清，采用酶联免疫吸附法检测血清Th1细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)，Th2细胞因子IL-4、IL-6，Treg细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)、IL-10，Th17细胞因子IL-17A、IL-22。试剂盒由上海酶联生物科技有限公司生产。

1.3.2妊娠结局比较统计两组妊娠成功率，以妊娠≥28周且经B超检查提示宫内活胎，未见胎盘、羊水或胎儿异常。随访成功妊娠者妊娠结局，统计早产或足月分娩率、胎儿生长受限(FGR)、妊娠期糖尿病(GDM)及妊娠期高血压疾病(HDCP)等发生率。

1.3.3安全性评价治疗前后各进行1次血常规、肝肾功能等检查，评价用药安全性，统计治疗期间药物副反应发生情况。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

研究期间脱落或剔除分别2例、6例，最终完成研究观察组73例、对照组69例。两组基本资料比较无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组基线资料比较

2.2 两组治疗前后Th1/Th2细胞比较

两组治疗前Th1、Th2及Th1/Th2比值均无差异(P>0.05)；治疗后，两组Th1、Th1/Th2比值均下降且观察组低于对照组，两组Th2均升高且观察组高于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组治疗前后Th1/Th2细胞比较

2.3 两组治疗前后Th1/Th2细胞因子比较

两组治疗前血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6水平及IFN-γ/IL-4比值均无差异(P>0.05)；治疗后，两组IL-2、IFN-γ、水平及IFN-γ/IL-4比值均下降且观察组低于对照组，两组IL-4、IL-6水平均升高且观察组高于对照组(均P<0.05)。见表3。

表3 两组治疗前后Th1/Th2细胞因子比较

2.4 两组治疗前后Th17/Treg细胞比较

两组治疗前Th17、Treg及Th17/Treg比值均无差异(P>0.05)；治疗后，两组Th17、Th17/Treg比值均下降且观察组低于对照组，两组Treg均升高且观察组高于对照组(均P<0.05)。见表4。

表4 两组治疗前后Th17/Treg细胞比较

2.5 两组治疗前后Th17/Treg细胞因子比较

治疗前，两组血清IL-17A、IL-22、TGF-β、IL-10、IL-17A/IL-10水平比较均无差异(P>0.05)；治疗后，两组IL-17A、IL-22、IL-17A/IL-10均降低且观察组低于对照组，两组TGF-β、IL-10水平均升高且观察组高对照组(均P<0.05)。见表5。

表5 两组治疗前后Th17/Treg细胞因子比较

2.6 两组妊娠情况比较

观察组妊娠成功率高于对照组(χ2=5.245，P=0.022)；妊娠成功者中，早产率观察组低于对照组(χ2=6.785，P=0.009)，FGR、GDM、HDCP发生率两组无差异(χ2=0.347、0.004、3.112，P=0.556、0.952、0.078)。见表6。

表6 两组妊娠情况比较[例(%)]

2.7 安全性评价

治疗期间两组均未发生用药相关不良反应。

3 讨论

同种免疫型RSA的发生机制目前主要认为与封闭抗体(BA)缺乏、人类白细胞抗原(HLA)高度组织相容性以及免疫细胞异常有关[6]。使用黄体酮、肌注HCG等常规保胎治疗同种免疫型RSA效果有限，临床多主张在孕前及孕早期采用LIT，可刺激机体产生BA，促进母体免疫耐受，提高妊娠成功率，有效率可达70%～90%[7]。本研究中，对照组采用LIT治疗后妊娠成功率达73.9%，但再次流产率仍较高(26.1%)，且在妊娠成功者中仍有19.6%早产，治疗效果有待提高。

中医药在保胎治疗中具有独特优势，且被证实联合西医可提高成功妊娠率及足月分娩率。RSA属中医“胎动不安”、“滑胎”范畴，病机主要与脾肾亏虚及气血不足有关；治疗当取健脾、补肾、补气、养血、健脾之法[8]。孕康口服液是临床常用保胎中药制剂，由黄芪、黄芩、菟丝子、续断等23味中药制成。黄芪补中益气、补气生血，山药健脾补肺、固肾益精，党参补中益气，白术健脾益气，共奏健脾、补肺、益气的功效；续断与桑寄生补肝益肾、强壮筋骨、条畅血脉，杜仲强腰益肾，狗脊补肝肾、强腰膝，补骨脂、白术补肾壮阳、补脾健胃、安胎，均可固肾纳气安胎；地黄、菟丝子及枸杞子等滋补肝肾、补肾健脾，茯苓健脾宁心，山茱萸补益肝肾、补血固精、调气补虚；砂仁、益智、乌梅醒脾和胃、止呕健胎；当归活血补血，白芍养血调经、敛阴止汗，阿胶安胎养血，艾叶活血温宫，苎麻根与黄芩止血安胎，诸药配伍共奏补肾健脾、养血安胎等功效。本研究结果显示，观察组LIT联合孕康口服液治疗，妊娠成功率提升至90.1%，证实孕康口服液联合治疗能提高患者保胎成功率；同时，观察组妊娠成功者中足月分娩率达93.8%，较对照组明显提高，这与孕康口服液的安胎作用有关。但两组在FGR、GDM、HDCP等发生率方面并无明显差异，考虑为妊娠并发症的发生机制复杂，临床观察中难以剔除相关干扰因素；加之样本量较小，导致研究结果存在偏倚。孕康口服液改善同种免疫型RSA患者妊娠结局尚待进一步研究。

成功妊娠有赖于母-胎界面复杂的免疫调控机制，免疫功能失调在RSA尤其是同种免疫型RSA发生中具有重要作用已获得广泛认可，且经证实RSA无论是子宫蜕膜组织还是外周血均存在Th1/Th2/Th17/Treg平衡紊乱[9-10]。本研究中，两组治疗前均表现为Th1/Th2向Th1漂移、Th17/Treg向Th17漂移。Th1细胞的效应因子IL-2、IFN-γ可介导细胞免疫反应，且在胚胎种植前后均参与血管构建以及转型等过程，但过表达可抑制胚胎着床，影响胚胎正常发育，介导胎盘栓塞而增加死胎风险等；Th2细胞的效应因子IL-4、IL-10介导体液免疫反应，具有抑制炎症反应及保护组织损伤等作用[11]；Th17/Treg平衡也与妊娠维持有密切关系，Treg可抑制母体自身免疫反应，从而获得并维持免疫耐受，在孕早期呈升高趋势，孕中期达到峰值水平，在产后可回降至低水平状态，但在RSA患者中并无此明显变化；Th17则可通过分泌IL-17而介导趋化因子生成，可对胎儿产生免疫排斥作用，即Th17/Treg平衡向Th17漂移可参与母体对胎儿的免疫抑制，导致RSA发生[12]。Th17细胞分化过程的启动由TGF-β和IL-6共同介导，二者可抑制Th1细胞功能，IL-10可促进Th17向Treg转换，而Treg则又可对Th1、Th2、Th17产生调控效应[13-14]。因此，妊娠免疫并非单纯依靠Th1/Th2平衡或Th17/Treg平衡，而是受4种细胞亚群及相关细胞因子间相互作用的影响。

本研究结果显示，两组治疗后Th1细胞因子和Th17细胞因子表达水平均明显下降，Th2细胞因子、Terg细胞因子表达均升高，且观察组改善程度优于对照组；两组Th1/Th2、Th17/Treg及IFN-γ/IL-4、IL-17A/IL-10比值均明显下降，且观察组下降幅度更明显。提示Th1/Th2、Th17/Treg平衡及其细胞因子表达与妊娠成功有关，联用孕康口服液较单纯LIT治疗能更好纠正Th1/Th2、Th17/Treg平衡紊乱，恢复Th2、Treg优势表达进而维持妊娠。分析原因：可能是由于中医认为的“脾肾正虚”与免疫功能失调关系密切，孕康口服液补肾健脾功效与西医调节免疫紊乱相符；同时，免疫紊乱及反复流产所致“血瘀”有碍新血养胎，孕康口服液补气生血、养血作用更有利于妊娠维持。药理学研究亦已证实菟丝子、枸杞子、地黄等活性成分具有促进血管修复、增生及抗流产等作用[15]；黄芪、黄芩能够调节子宫免疫微环境而发挥保胎作用[16]；茯苓多糖能够调节RSA小鼠的Th17/Treg免疫细胞平衡紊乱，改善妊娠不良结局[17]。另有大量研究显示，补肾类中药能够改善子宫内膜受容性、保护母体免疫功能等而发挥抗流产作用[18-20]。本研究两组均未见明显药物不良反应，提示加用孕康口服液并未增加副反应，用药安全性良好。

综上所述，LIT联合孕康口服液治疗同种免疫型RSA疗效更佳，可提高妊娠成功率及足月分娩率且安全性良好；其机制可能与调节Th1/Th2/Th17/Treg平衡紊乱，促进母胎界面免疫平衡而发挥保胎作用有关。