活血生骨汤治疗激素性股骨头坏死的分子机制研究

李 楠 董汝军

山东省聊城市中医医院骨科，山东聊城 252000

大剂量长期或短期冲击应用糖皮质激素类药物引起股骨头周围静脉回流不畅、动脉血供不足是激素性股骨头坏死（steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH）的主要发病原因[1-2]。随着糖皮质激素类药物在临床上的广泛应用，SONFH的发病率逐年攀升，已经成为临床最常见的非创伤性股骨头坏死类型[3]。SONFH 病程发展迅速，并且伴随着严重的髋关节疼痛和疾病后期股骨头塌陷造成的髋关节骨性关节炎。因此，SONFH 的发病机制与治疗方式已经成为骨科领域学者的研究热点。

随着对SONSH 研究的不断加深，中医药防治SONFH 取得的疗效受到广泛关注。SONFH 的中医病机为肾虚血瘀、骨枯髓消，根据辨证论治的中医理论特点，临床多采用补肾活血、生骨祛瘀类药物相互配伍。活血生骨汤（专利申请者：李楠，专利题名：活血生骨汤，国别：中华人民共和国，专利号：ZL201410684814.1，授权公告号：CN 104474128 B，专利发布日期：2018年8月14日）是本课题组前期研究中已获得国家专利的治疗SONFH 的临床经验方，由当归、川芎、牛膝、防己、赤芍、丹参、茯苓、枸杞子、红花、木香、鹿角胶、淫羊藿、羌活、独活、白芷、伸筋草、骨碎补、杜仲、甘草等药物组成，其中丹参活血祛瘀，主治气滞血瘀之征，淫羊藿补肾壮阳，二者合用，起到活血祛瘀、补肾壮骨之功效。红花、当归、川芎、鹿角胶、杜仲、枸杞、牛膝发挥活血通络、补益肝肾的功效。骨碎补、赤芍、茯苓散瘀消肿、缓急止痛，独活、羌活、防己、白芷可祛风止痛，木香行气止痛，伸筋草祛风湿、舒筋活络，诸药合用可改善局部疼痛、活动受限等症状，共奏补肾活血、生骨祛瘀之功效。为了进一步阐释活血生骨汤治疗SONFH 具体的药理学作用与分子机制，本研究基于生物信息学与网络药理学研究方法，整合筛选高通量数据，并采用分子对接技术验证潜在有效成分与核心靶点的结合活性，探讨活血生骨汤治疗SONFH 的分子机制。

1 资料与方法

1.1 获取与筛选药物成分

借助BATMAN-TCM 药物成分数据库[4]（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），以“当归、川芎、牛膝、防己、赤芍、丹参、茯苓、枸杞子、红花、木香、鹿角胶、淫羊藿、羌活、独活、白芷、伸筋草、骨碎补、杜仲、甘草”作为检索词，检索活血生骨汤的有效活性成分及相关潜在靶点。参数设置“药物-靶点”相似性模型分数Score cutoff ≥20，AdjP-value ≤0.05，分析筛选获得活血生骨汤的有效活性成分及相关潜在靶点。

1.2 获取疾病差异基因

利用基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO），检索词“steroid-induced osteonecrosis of the femoral head”，筛选并下载SONFH 相关芯片GSE123568 原始数据。使用R 语言Affy 软件包及limma 软件包进行强制归一化处理，并筛选差异表达基因，设置差异倍数（fold change，FC）为|log2FC|≥1，P值<0.01，采用heatmap 软件包绘制聚类图。

1.3 构建PPI蛋白互作网络并分析

借助STRING 数据库（http: /string-db.org/），构建本研究的关键靶点的蛋白相互作用网络。物种设置为“Homo sapiens”，最大置信数值（highest confidence）设置为0.7。获得的数据映射处理后导入Cytoscape 软件，利用Cytoscape 软件完成PPI蛋白互作网络的网络拓扑分析，根据度值（degree，DC）确定网络核心靶点。

1.4 KEGG与GO功能富集分析

利用Metascape 数据库[5]（http: //metascape.org/）完成关键靶点的批量基因分析，进行基因本体论（gene ontolog，GO）生物学过程功能富集分析及京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析。通过参考错误发现率（false discovery rate，FDR）与P值过滤富集结果，输出结果的气泡图。

1.5 分子对接验证

根据PPI 蛋白互作网络，选择度值（DC）的前10 位作为核心靶点，通过计算结合能量、明确结合键位的方式，确定相关药物潜在有效成分的结合活性。

通过PDB 数据库[6]（http: //www.rcsb.org/）获得靶点蛋白的蛋白结构文件，设置物种为“Homo sapiens”，选择解析度较小的蛋白结构文件。通过Pymol 软件完成修饰操作后导入Auto dock 软件，经过计算电荷数等一系列操作后，后以pdbqt 格式导出。最终借助Autodock Vina 软件完成分子对接的计算过程，获得结合能数值。根据结合能数值确定最优结合构象。利用PyMOL 软件及PLIP 数据库[7]（https: //plip.biotec.tu-dresden.de/）可视化对接结果。

2 结果

2.1 活血生骨汤的潜在活性成分与靶点预测

通过BATMAN-TCM 数据库检索及条件筛选后，共获得活血生骨汤组方中潜在有效成分561 个，数据库预测潜在有效成分作用靶点1263 个。

2.2 SONFH的差异基因

通过GEO 数据库获得芯片GSE123568 数据。芯片共纳入了30 个SONFH 患者样本及10 个空白对照样本。借助R 语言分析工具共获得717 个差异表达基因，其中上调基因数为431 个，下调基因数为286 个。聚类图结果见图1。

2.3 PPI蛋白互作网络分析

将2.1 与2.2 所获得的靶点映射处理，共获得74 个共有靶点，结果见图2。利用STRING 数据库构建活血生骨汤治疗SONFH 的PPI 蛋白互作网络。PPI 蛋白互作网络中共有节点50 个，蛋白互作关系88 条，其中，度值由高到低排序前十位的靶点分别为MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2，将其定义为此PPI 网络中的核心靶点。PPI 蛋白互作网络见图3。

2.4 富集分析结果

本研究通过Metascape 数据库完成上述PPI 蛋白互作网络靶点的富集分析。GO 功能生物学进程分析结果显示，相关靶点在氧化应激反应、细胞的分化与迁移、细胞对激素的刺激反应、药物代谢、免疫系统的正向调节和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联的调节等生物学进程上显著富集。KEGG 信号通路分析结果显示，活血生骨汤治疗SONFH 的可能关键靶点主要富集于催产素信号通路、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路、Notch 信号通路、破骨细胞分化信号通路、钙信号通路及TNF 信号通路等信号通路，富集分析结果见图4。

2.5 分子对接结果

选取PPI 网络中前5 位关键靶点完成分子对接验证。分子对接技术中，大分子与小分子配体的结合能越低，则其互相产生稳定结合相互作用的可能性越大。本研究分子对接结果显示，关键靶点与潜在活性成分的结合能均<-5 kCal/mol，产生稳定结合相互作用的可能较大。见表1，对接可视化结果见图5。

表1 活性成分与关键靶点对接结果

3 讨论

随着糖皮质激素类药物广泛应用于临床疾病治疗，糖皮质激素引发的继发性疾病开始受到关注。其中，SONFH 已经成为股骨头坏死临床最为常见的类型，发病率居非创伤性股骨头坏死首位。流行病学调查结果显示，我国SONFH 发病率占24.1%[8]。基于国内外股骨头坏死领域研究的不断深入，对于SONFH 的致病原因已经较为明确，但其病理生理学机制尚不清楚。现阶段较为公认的血管活性因子异常表达学说认为，由于糖皮质激素的过量使用，造成了股骨头周围微环境中调控血管生成的活性细胞因子水平异常，股骨头部位的血管生成过程受阻，影响了股骨头周围供血不良和微循环降低，缺氧缺血的环境导致骨细胞动态平衡破坏，最终引起股骨头坏死[9]。

中医学一般将股骨头坏死归类于“骨痹”“骨蚀”等范畴，主要是由于肾阳衰微，无以濡养筋骨，骨枯髓消导致的股骨头病理改变。本研究采用的临床验方“活血生骨汤”具有补肾活血、生骨祛瘀的功效，临床用药基于中医辨证论治充分考量患者个性病情加减化裁，取得了良好的治疗效果。由于中药成分过于复杂且难以完成定量定性的相关研究，中药复方对于相应疾病治疗过程的作用机制并不十分明确。本研究基于网络药理学、生物信息学与分子对接的技术，进一步分析了中药复方活血生骨汤治疗SONFH 的活性成分、潜在作用靶点与作用通路及其分子作用机制。

本研究结果显示，活血生骨汤通过白桦脂醇、丹参素和18β-甘草次酸等多种潜在化学成分，可能作用于MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2 等蛋白靶点调控氧化应激反应、细胞的分化与迁移、细胞对激素的刺激反应、药物代谢、免疫系统的正向调节和MAPK 级联等生物学进程，影响催产素信号通路、VEGF 信号通路、Notch 信号通路、破骨细胞分化等多条通路调控共同发挥治疗SONFH 的药理作用。

根据BATMAN 数据库获取的成分靶点关系筛选结果，关键靶点与白桦脂醇、丹参素、18β-甘草次酸和去氢丹参新酮等成分关联度较高。白桦脂醇广泛存在于中药植物类药物中，具有降脂、抗炎、抗心肌缺血等多种药理作用[10-11]。白桦脂醇可以明显抑制血管中的IL-6、TNF-α 等炎症因子表达从而改善高脂血症模型小鼠动脉血管的病理学改变[12]，该过程或与改善脂代谢与血管内皮功能失衡及抑制IKKβ/NF-κB 信号通路减少症反应的级联放大有关。丹参素是中药丹参的主要水溶性成分，药物动力学研究已得到证明[13-16]。其保护心肌细胞、抗炎、抗血栓形成等作用已得到了广泛的临床应用。补肾活血汤的多种成分均具有血管新生、抗炎、抗血栓形成和骨组织代谢等作用，其或通过这些成分发挥对于SONFH 的治疗作用。

PPI 蛋白互作网络显示，MAPK1、NOTCH1、PTGS2、LRRK2、SNCA、PPP3R1、PPP3CB、KLF4、AIF1、NOTCH2 等在网络中度值较高且明显差异表达，是该网络中的关键靶点。MAPK1 作为MAP 激酶信号传导的重要组成部分，参与到MAPK/ERK级联中介导转录、翻译、细胞骨架形成等多种生物学功能。NOTCH1 存在着对骨吸收的抑制作用，而NOTCH2 在介导破骨细胞生成与骨吸收作用方面发挥作用[17-18]。NOTCH1 在成骨细胞中的激活会导致骨形成过程受损。与NOTCH1 作用相反，NOTCH2 通过诱导成骨细胞核因子激活加速骨细胞生成。PTGS2 在炎症反应中具有特殊作用，PTSG1 与PTGS2 是诸多非甾体抗炎药物的靶标[19-21]。LRRK2 与帕金森病具有非常密切的关系[22]，其病理性突变可增加激酶活性，从而加速细胞的死亡过程。

GO 生物学功能分析结果反映了治疗过程与氧化应激反应、细胞的分化与迁移、细胞对激素的刺激反应、免疫系统的正向调节和MAPK 级联等生物学进程具有较高的相关性。KEGG 信号通路富集分析结果中，催产素信号通路、VEGF 信号通路、Notch 信号通路、破骨细胞分化、钙信号通路等信号通路在活血生骨汤SONFH 的治疗过程中明显富集。VEGF 是VEGF 信号通路中的关键因子，在调控血管通透性与调节血管内皮细胞代谢等方面具有重要作用，其作为促血管形成细胞因子，在骨组织分化、骨基质形成与细胞因子的发生发展存在密切联系[23]。Notch 信号通路在哺乳动物组织的发育和维持中起到了传递相关信息的作用。在骨组织中，成骨细胞与破骨细胞的分化与正常功能表达都需要Notch 信号通路参与[24]。在骨组织的发育过程中，细胞在体内受到多个信号通路的共同作用，如Notch 信号通路与Wnt 信号通路在骨细胞中存在关联机制，Wnt 信号通过诱导Notch 信号，在调节骨细胞分化与内稳态的调节方面发挥了重要的相互作用。还有研究表明，在前体脂肪细胞分化与骨髓间充质干细胞分化过程中，Notch 信号通路也发挥了重要作用[25]。Notch 信号通路对骨量动态平衡的维持过程呈双向调节。因此，深入研究Notch 信号通路在骨代谢方面的具体作用机制，对于SONFH 发病机制的探索和新的治疗思路的提出具有重要意义。破骨细胞分化主要受到RANKL 和免疫受体激活的信号通路调节，有研究表明，破骨细胞与免疫系统中的大多数细胞相互作用，在某些自身免疫性疾病中，T 细胞与破骨细胞均可被异常激活[26-27]。

分子对接结果显示，关键靶点与其反向寻找的化学有效成分的对接结合能量均<-5 kCal/mol，这表示潜在活性药物小分子与靶点蛋白的结合活性较好。

结合本研究结果，获得了活血生骨汤治疗SONFH 的潜在有效成分和关键靶点。根据GO 生物学功能富集分析与KEGG 信号通路富集分析结果，进一步讨论了活血生骨汤治疗SONFH 可能存在的多种生物学进程与相关的信号通路。并通过分子对接技术验证了潜在活性成分与SONFH 关键靶点的结合效果，明确了SONFH 治疗过程可能的作用机制。综上，研究基于生物信息学与网络药理学的方法，对活血生骨汤组方治疗SONFH 的作用机制进行了探索，但仍需后续实验进一步观察研究特定靶点与单体成分在病理过程中的作用。