甲基莲心碱逆转人肝癌细胞索拉非尼耐药的体外研究及其对PI3K-Akt通路的影响

易晓雷 肖 浩 李旭辉 刘志鹏 谢 明

长沙市中医医院 （长沙市第八医院）肝胆胰·血管外科，湖南长沙 410100

肝癌是全球发病率高、病死率高的恶性肿瘤之一，5年内生存率仅为18%，是仅次于胰腺癌的第二大致命性肿瘤[1]。肝癌是一种常见的原发性肝癌类型，占85%左右，其显著特点主要为易转移、易复发、预后差及高病死率[2]。肝切除、肝移植、射频消融、经动脉化疗栓塞和放射性栓塞术是目前肝癌治疗中常见的方法[3]，但大多数患者发现时都已经到了中、晚期，错过了最好的处理时间，因此大多数患者的预后较差[4-5]。第一个经美国食品药品监督管理局（FDA）通过用于治疗晚期肝癌的多靶点抗肿瘤一线药为索拉非尼（sorafenib，SORA）[6]，能通过对丝氨酸-苏氨酸激酶（c-RAF）的抑制，阻断RAF/MEK/ERK 介导的信号途径，从而达到抑制癌细胞生长的目的；有研究表明还可通过酪氨酸激酶受体的抑制，如血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）和血小板衍生生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR），从而阻止新的肿瘤血管生成，具有抑制肿瘤细胞生长和肿瘤新生血管形成的双重作用[7]。但是大多数患者在服用SORA 数月后会产生对药物的抗药性，目前尚未充分了解其作用机制，降低药物耐药性是改善肝癌治疗效果的一个重要因素。双苄基异喹啉生物碱—甲基莲心碱（neferine，Nef）由睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽中提取[8]，研究发现Nef 具有抗肿瘤作用，而且可以减少肿瘤对化疗药物的耐药性。有研究报道，Nef 对SGC7901/VCR 的多药物抗性有明显的抑制作用[9]。但Nef 在肝癌耐药中的研究尚未见报道。故本研究通过观察Nef 对耐SORA 肝癌HepG2 细胞株耐受性的影响，探讨其对人肝癌耐药细胞株HepG2/SORA 耐药性的逆转作用及其可能机制，为Nef 应用于肝癌的临床化疗增敏治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 细胞 人肝癌耐药细胞株HepG2/SORA（上海酶联生物科技有限公司）。

1.1.2 主要试剂 含胎牛血清（10%）的DMEM高糖细胞培养基、SORA 和Nef 购自济南精合医药科技有限公司。噻唑蓝（MTT）细胞增殖检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；二甲亚砜（DMSO，济南广宇化工有限公司）；多聚甲醛（南京高和化学工业有限责任公司）40 ng/L；上海实验试剂有限公司购买的磷酸盐缓冲剂（PBS）；购自济宁泰华化工科技有限公司的荧光消除剂；末端转移酶（TdT）反应液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、双蒸水均于北京酷来博科技有限公司购买；TUNE 细胞凋亡检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。RIPA 蛋白裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；兔抗人Akt 和p-Akt（Ser473）多克隆抗体及β-actin 一抗及二抗（HRP，美国Abcam 公司）。

1.1.3 主要仪器 TGL16M 台式高速离心机（凯特实验仪器有限公司）；YCP-400Q 细胞CO2培养箱（美长沙华曦电子科技有限公司）；88-55030 光学显微镜（宝视德有限公司）；天诺翔TN-60 荧光倒置显微镜（深圳天诺翔网络科技有限公司）；赛默飞全波长酶标仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）；THT-96G 聚合酶链反应（PCR）扩增仪（上海净信实业有限公司）；DYCZ-24DN 电泳槽（冠兆仪器旗舰店）；DYCZ-24DN 蛋白凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；Trans-Bloy Turbo 转膜仪（上海艾研生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 首先用含胎牛血清（10%）的DMEM 高糖细胞培养基对人肝癌耐药细胞HepG2/SORA进行初次的细胞培养，然后将其放置在5% CO2浓度的细胞培养箱中，且箱内温度控制在37℃左右，当细胞融合达80%时，将细胞接种于6 孔板中，并随机分为4 组：空白对照组、SORA 组（IC50 浓度）、Nef 组[（5.00±0.57）μmol/L]、SORA[（IC50 浓度）+Nef（5.00±0.57）μmol/L]联合组。将对应浓度的药剂分别添加到不同的培养基中，空白对照组添加相同体积的培养基。然后进行56 h 的细胞培养。

1.2.2 细胞增殖抑制作用检测 采用MTT 法检测细胞增殖抑制率。将细胞接种于96 孔板中培养，添加0.5% MTT 反应溶液后，将细胞放入5% CO2浓度，且箱内温度控制在37℃左右的细胞培养箱中，再进行4 h 的培养。弃上清，摇动培养10 min 后，各孔加入150 μl 二甲基亚砜，然后用酶标记器读取每个样品的孔光吸收率（OD），在570 nm 处。细胞增殖抑制率=[1-实验组（Nef 组、SORA 组及联用组）OD 值/空白对照组OD 组]×100%。

1.2.3 细胞凋亡检测 待给药结束后，用TUNEL法检测不同组间细胞凋亡指标。收集细胞，将细胞涂片后自然晾干，再放入40 ng/L 多聚甲醛溶液中，进行1 h 左右的浸泡，用PBS 漂洗后，样本浸泡于3% H2O2中30 min，PBS 漂洗后，将试样浸泡于PBS中，此处需用含1% Triton-X-100 的PBS 浸泡30 min；然后再进行PBS 漂洗，滴入50 μl 的TdT反应溶液到样品中，用遮光法进行1 h 的遮光处理；然后用PBS 冲洗，加入50 μl 的染料，在阴凉下进行30 min 的处理，然后用DAPI 对细胞进行复染；经PBS 清洗后，用荧光消除剂密封，并用荧光显微镜进行观察。在各标本中，随机挑选3 个视野，统计各组凋亡的阳性细胞数和视野中能看见的总细胞数。细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 Western Blot 法测定各组p-Akt、Akt 表达 待各组细胞给药结束后，收集各组细胞至离心管中，然后将等浓度细胞裂解液加入各组试管内，于4℃下摇动培养一晚，培养结束后收集各组细胞液，10 000×g，4℃，进行10 min 的离心，然后各组上方清液即为细胞总蛋白，加上样缓冲液，在沸水中煮5 min。取各组蛋白上样，进行凝胶电泳，转膜，使用体积分数5%脱脂牛奶于摇床上室温封闭2 h，PBST 清洗3 次，加一抗4℃孵育过夜，PBST 清洗3 次，加二抗温孵育2 h，曝光。根据条带灰度值，以β-actin 为内参，计算目的蛋白相对表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较使用单因素方差分析，两组间比较使用SNK-q检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同药物对HepG2/SORA细胞凋亡率的影响

SORA 组、Nef 组、SORA+Nef 组与空白对照组相比，细胞凋亡率有明显差异，空白对照组的凋亡率低于SORA 组、Nef 组和SORA+Nef 组，差异有统计学意义（P< 0.05）；而SORA 组、Nef 组和SORA+Nef组比较，SORA+Nef组的凋亡率高于SORA组、Nef组，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表1。

表1 不同药物对HepG2/SORA细胞凋亡率的影响

2.2 不同药物对HepG2/SORA细胞增殖抑制率的影响

SORA 组、Nef 组、Nef+SORA 联合组的增殖抑制率明显高于空白对照组（P< 0.05）；与SORA相比，Nef 组和Nef+SORA 联合组的细胞增殖抑制率明显提高，差异有统计学意义（P< 0.05）；SORA+Nef 联合组细胞增殖抑制率明显高于Nef 组，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表2。

表2 不同药物对HepG2/SORA细胞增殖抑制率的影响

2.3 不同药物对HepG2/SORA细胞p-Akt、Akt和β-actin蛋白表达影响

Western Blot 法测定各组p-Akt、Akt 表达。蛋白印迹结果表明，SORA 联合Nef 能显著降低p-Akt及Akt 的表达，而SORA 组中p-Akt 及Akt 的表达高于空白对照组及Nef 组。见图1。

3 讨论

多个信号途径和多个遗传基因联合导致了肝癌的发生，在某些方面，化学疗法和靶向药物能有效地延长其无病生存和总体生存时间，并能改善患者的预后，但是对原药和继发药的抗药性依然是决定其预后的主要原因[10]。在这之中，PI3K-Akt 通路是肝癌关键通路，在30%～50%的肝癌患者中，其体内这一通路被明显活化，Akt 活化是影响肝癌生存期较低的一个重要因子[11]。当前，PI3K-Akt通路与肝癌耐药的相关性引起广泛关注。有研究表明在耐药细胞株SORA 持续作用下激活了PI3K-Akt通路[12]。Nef 是一类双苄基异喹啉药物，近年开始成为研究肿瘤耐药的热点。Qin 等[13]实验显示，Nef 可以明显减少人慢性髓性白血病细胞株K562/G01对伊马替尼的药物敏感性，这可能与ABC 转运素P-gp 的激活密切相关。Zhou 等[14]也证实Nef 与高热作用可使ABC 中Pgp、MDR1 mRNA 含量下降，从而使SGC7901/ADM 多药耐药性下降，从而降低SGC7901/ADM 的多药耐药水平。另外，MCF-7/ADR对乳癌的抗药性也得到了证实[15]。Nef 能抑制卵巢肿瘤细胞的生长，其作用机制是活化p38MAPK/JNK通路，抑制mTOR 通路活化，进而诱发肿瘤细胞的自噬[14]。在肺癌A549 细胞株中，有研究[16]表明Nef 可通过富集氧自由基、抑制PI3K-Akt/mTOR 而诱导自噬，从而抑制肺癌细胞增殖。

本研究发现SORA 耐药细胞HepG2/SORA 中p-Akt、Akt 蛋白表达显著上调（P< 0.05），表明耐药细胞中PI3K-Akt 通路被激活。Nef 与SORA 联用能显著降低p-Akt、Akt 蛋白表达（P< 0.05），表明该通路已受抑制，提示Nef 与SORA 联用可以通过多靶点逆转耐药、增强药物作用敏感性，因此具有潜在应用价值。已有研究发现在SORA 耐药的肝癌细胞中，能通过抑制Akt 将自噬从细胞保护作用转变为促死亡机制，逆转对SORA 的获得性耐药[17]。本研究也证实Nef 抑制SORA 获得性耐药关键靶点Akt的磷酸化，抑制PI3K-Akt 通路。提示Nef 与SORA联用可能将自噬从细胞保护作用转变为促死亡，为研发调控自噬的抗肿瘤药物提供了新思路，但具体机制还需要后续深入探究。综上所述，本研究结果提示Nef 能增强SORA 敏感性，有效逆转HepG2/SORA 耐药细胞对SORA 的耐药，其机制可能与抑制PI3K-Akt 信号通路相关。因此，进一步深入研究对临床解决SORA 耐药问题具有重要意义。