肠道菌群影响缺血性卒中后免疫状态研究进展☆

谢佳惠 任悦冉 尹恝

缺血性卒中（ischemic stroke,IS）发病后，小胶质细胞激活，外周固有免疫细胞（如单核-巨噬细胞）和适应性免疫细胞（如B细胞、T细胞）被大量募集至缺血半球，不利于IS预后[1-4]。研究证实被募集至缺血半球的免疫细胞中部分起源于肠道[5]，且受肠道菌群影响[6]。肠道菌群是人体内的庞大生物群体，与免疫系统显著相关[7]。IS这一急性应激改变了肠道菌群的构成、丰度、代谢产物水平[8-11]。调控肠道菌群及其代谢产物水平可影响IS后的免疫状态，影响IS预后[6,12]。在此就肠道菌群影响IS免疫状态的临床和基础研究做一综述，旨在为肠道菌群影响IS预后的机制研究提供理论基础，为改善IS预后提供调控肠道菌群这一新思路。

1 IS后肠道菌群及其代谢产物的变化

1.1 肠道菌群构成和多样性的变化 在生理情况下，健康成人肠道菌群保持动态平衡，最富有的菌群是厌氧菌和瘤胃梭菌[10,13]。疾病可改变肠道菌群构成和多样性，研究发现曾患重大疾病的非健康老龄化人群肠道链球菌属丰度显著高于健康老龄化人群[14]。发生IS后，患者和实验动物的肠道菌群构成显著改变、物种多样性显著降低。HAAK等[15]发现与对照组相比，IS患者肠道菌群α多样性和β多样性降低，变形菌门、肠杆菌科、大肠杆菌属丰度显著升高。在IS动物模型中，肠道菌群的多样性、变形菌门和肠杆菌科的丰度变化都与IS患者相似[11,16-18]。XU等[8]证实，在IS后肠道菌群的诸多变化中，改变最明显的是变形菌门肠杆菌科，其丰度在IS急性期显著升高。综上所述，IS后肠道菌群组成和多样性发生显著改变。不论在人还是实验动物中，IS都能降低肠道菌群多样性、升高变形菌门肠杆菌科丰度。分析原因可能是IS这一急性应激诱导肠道缺血，缺血的肠道发生自由基反应产生大量硝酸盐，从而利于变形菌门肠杆菌科这一进行硝酸盐呼吸的菌群生长，进而加重炎症反应，不利于IS预后[8]。

1.2 肠道菌群代谢产物水平的变化 肠道菌群代谢产物包括氧化三甲胺（trimethylamine oxide,TMAO）、短链脂肪酸（short chain fatty acids,SCFAs）等物质水平也受IS影响。

饮食中的营养素如胆碱等可由肠道菌群特异加工产生三甲胺（trimethylamine,TMA），TMA由肠道吸收后在肝脏单加氧酶作用下转化为TMAO[19]。发生IS后，患者血浆TMAO水平呈现在急性期先升高后降低，在慢性期升高的动态变化[9]。以美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）评分等于6分为界划定的中重度IS患者血浆TMAO水平显著高于轻度IS患者，并且在急性期升高的血浆TMAO水平与梗死体积增加相关[20]。血浆高TMAO水平不仅与梗死体积、IS严重度相关，还能增加IS复发及心血管事件风险[21]。发生IS后患者肠道菌群中产TMA细菌属丰度升高可解释血浆高TMAO水平这一现象，而产丁酸菌丰度降低也提示IS后SCFAs水平的变化[15-16]。

SCFAs由肠道菌群代谢不可消化纤维产生，包括醋酸、丁酸、丙酸等，可通过多种途径发挥稳定肠道作用，且近期已被证实可通过血脑屏障[22-23]。研究发现，发生IS后，患者和实验动物的粪便SCFAs水平显著降低[10,24]，实验动物血浆SCFAs水平也显著降低[23]。不论是人群研究还是动物实验，IS后粪便SCFAs水平与神经系统评分和脑梗死体积负相关[10,24]。不仅如此，粪便SCFAs水平还与IS患者长期功能预后评分负相关[10]。上述结果提示直接调控菌群代谢产物水平如TMAO、SCFAs，或能成为促进IS预后的方法之一。

2 肠道菌群影响IS后固有免疫

固有免疫的激活能显著影响IS发展及预后。在IS超急性期脑实质小胶质细胞胞浆内钙超载引发白细胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18等促炎因子释放，加重缺血性脑损伤[4,25]。IS后24 h可见大量与脑血管相关的单核细胞浸润脑实质且在第3天达高峰[2,26]。IS后浸润脑组织的巨噬细胞与循环血液巨噬细胞相比其识别与吞噬凋亡细胞的基因上调，如TREM1、JAK/STAT等信号转导通路相关基因；在IS亚急性期连同小胶质细胞吞噬清除死亡神经元[27]。浸润缺血脑组织和损伤区域血管内的中性粒细胞吞噬功能下降，表达高水平活性氧，加重缺血性脑损伤[28-30]。

IS发生后，浸润脑组织的固有免疫细胞可来自肠道[5]。BREA等[5]利用光转化技术发现肠道免疫细胞向周围的转移具有时间和空间的区别。在IS第3天，相较于免疫器官，肠源性CD11c+细胞更倾向转移至脑组织、脑膜。特殊的情况是，肠源性CD11c+细胞的迁移呈现出组织特异性，表现为从肠道转移至脑膜的CD11c+细胞主要为巨噬细胞，而从肠道转移至脑组织的CD11c+细胞包含巨噬细胞和树突状细胞。在IS第14天，急性炎症反应消退后，肠道免疫细胞向外周转移的空间差异性消失。

通过调控肠道菌群及其代谢产物水平可影响IS后的免疫状态。获得性肠道菌群定植无菌小鼠与无菌小鼠相比，其缺血半球小胶质细胞、巨噬细胞数量增加且大量激活，促炎因子如IL-1β、肿瘤坏死因子-α转录上调[6]。通过饮食干预提高血浆TMAO水平可升高小鼠血液中促炎型单核细胞（Ly6Chigh）水平，清除肠道菌群后则作用消失[21]。但是补充SCFAs可显著降低小鼠大脑小胶质细胞总数，并使其呈现分支增多、球形减少的低激活形态[23]。由此可见，需要有选择性地调控肠道菌群和代谢产物水平。

3 肠道菌群影响IS后适应性免疫

IS发生后，T细胞浸润缺血大脑半球。SELVARAJ等[1]发现在第14、30天小鼠缺血半球CD4+T、CD8+T细胞数量显著升高，与更差的功能预后相关。但抗CD4+T细胞治疗对小鼠梗死灶形成和死亡率无明显影响[3]，削减IS慢性期CD8+T细胞数量却能改善IS功能预后[1]。

IS发生后，外周适应性免疫细胞水平呈动态变化，且T细胞的变化与IS严重度和预后相关。LI等[32]发现IS患者血液B细胞占淋巴细胞百分比、CD8+T细胞占淋巴细胞百分比都表现为先升高后维持高水平的状态，而CD4+T细胞百分比表现为先升高后恢复的动态改变。特别的是，CD4+调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）百分比在入院、出院、发病1个月、发病3个月时表现为降低、升高、恢复、再升高的动态变化[32]。其中入院时CD4+Tregs水平降低与IS患者入院时更差的神经功能、出院时更差的NIHSS评分和mRS评分相关，并能良好预测发病3个月时的mRS评分[32]。XIA等[33]证实，对小鼠进行特异性干预后，CD4+Tregs细胞数量的扩增可减少小鼠大脑梗死体积和神经元死亡，并有利于长期预后。由此可见CD4+Tregs细胞的重要性，而B细胞对IS的作用则有待进一步研究。

综上，动物实验提示IS后脑组织浸润CD4+T细胞数量增加与卒中不良预后相关，但抗CD4+T细胞并不能改善梗死的严重程度。而人群队列的结果提示外周循环中CD4+Tregs数量下降与IS预后不良相关。多项研究的矛盾结果提示CD4+T细胞在IS过程中的复杂性，其中CD4+T细胞的另一个亚群辅助性T细胞（T helper cells,Th）17细胞也逐渐得到关注。发生IS后，尽管脑组织和循环血液中CD4+T细胞数量都有所增加，但Tregs/Th17比例都降低，伴随促炎因子IL-17A水平升高、抑炎因子转化生长因子-β水平降低[34-35]。而恢复脑组织和循环血液中的Tregs/Th17比例与IS后脑梗死体积减小以及长期功能预后相关[35]。因此，IS后CD4+T细胞、Tregs细胞、Th17细胞对IS预后所起作用需要综合考量，仍需进一步研究。

肠道菌群及其代谢产物影响IS后外周适应性免疫。发生IS后，获得性肠道菌群定植无菌小鼠与无菌小鼠相比脾脏T细胞、B细胞计数增加[6]，而增加的T细胞、B细胞部分来自肠道[5]。肠道中T细胞的数量变化与肠道菌群相关。IS后获得性肠道菌群定植无菌小鼠与无菌小鼠相比，肠道派氏节中Th细胞、极化Tregs、Th17细胞计数增加，同时缺血大脑中上述T细胞的mRNA水平也相应升高[6]。有趣的是，补充SCFAs可显著减少缺血脑组织的淋巴细胞数量和脾脏T细胞数量[23]。ASARAT等[36]证实SCFAs特别是丁酸盐能升高Tregs百分比，增加IL-10表达量，并降低Th17细胞百分比。SCHWARZ等[37]同样证实SCFAs能恢复循环血液中Tregs数量和IL-10、FOXP3表达量，恢复其免疫抑制功能。这些结果再次提示对菌群及代谢产物的调控需要有选择性。

4 IS后调控肠道菌群的价值

如前所述，IS改变肠道菌群构成、代谢产物水平，这两者可影响IS后的免疫状态，并与IS预后相关。临床研究证实IS后肠道菌群的改变如肠杆菌科丰度升高加重IS严重度[8]。国内一持续关注肠道菌群的研究团队在2018年发表的研究中提出IS患者肠道菌群构成发生显著改变后[38]，继续进行前瞻性队列研究证实IS后神经危重症患者肠道菌群中变形菌门肠杆菌科丰度升高与患者180 d死亡率相关[39]，该团队进行两个临床队列研究捕捉IS后肠道菌群的动态改变及其与IS预后的关系，并建立IS动物模型进一步阐释了相关机制，提出脑缺血迅速诱导肠道缺血并通过自由基反应产生过量硝酸盐导致肠道生态失调伴随肠杆菌科扩增，通过促进全身炎症加重脑梗死[8]。

通过调整肠道菌群可减轻小鼠缺血性脑损伤和神经功能缺陷、减小梗死体积，减轻脑水肿[24,40-41]。获得性肠道菌群定植无菌小鼠与无菌小鼠相比脑梗死体积减小[6]，但发生IS后，使用联合抗生素清除肠道菌群的小鼠脑梗死体积也减少。而接受万古霉素、氨苄西林单一处理的小鼠肠道拟杆菌S24-7丰度降低；疣微菌科、乳酸杆菌科、伯克氏菌科、链球菌科等丰度增加，都分别与大脑梗死体积降低有关[40]。这些结果提示进行菌群调控时要区分清除有害菌为主的异常菌群还是恢复有益菌为主的正常菌群。

肠道菌群代谢产物也可影响IS预后。急性IS患者粪便SCFAs水平下降，与IS不良功能预后相关[10]。在动物实验中补充丁酸盐、乙酸盐都能恢复肠道菌群的多样性和丰度，减小梗死体积，改善功能预后[12,24]。分析可能原因为补充SCFAs后，外周免疫器官及浸润中枢神经系统的淋巴细胞数量降低，且中枢神经系统小胶质细胞形态、数量、释放细胞因子的变化提示其处于未激活状态。进一步通过干预淋巴细胞缺陷型Rag1-/-小鼠阐明循环中的淋巴细胞介导了SCFAs对小胶质细胞的作用[23]。上述结果提示补充SCFAs能通过循环中的淋巴细胞调节小胶质细胞激活状态发挥神经保护作用。

IS发生后，肠道菌群构成及代谢产物水平显著改变，如肠杆菌科丰度升高、急性期TMAO水平升高、SCFAs水平降低等。多项研究都指出IS后肠杆菌科丰度升高，与IS严重度和预后相关，其中机制之一为IS后肠杆菌科丰度升高可促进全身炎症反应。动物实验已证实，调控肠道菌群及其代谢产物可降低小胶质细胞激活状态、影响IS后的固有免疫、获得性免疫，可改善IS预后。然而，在动物实验中所得成果尚缺乏临床数据支持和机制解释。虽然已有团队逐步探明，IS引起肠缺血后造成肠杆菌科扩增，通过促进炎症反应影响IS预后，但关于IS影响肠道菌群的机制以及肠道菌群影响IS预后的机制研究仍然欠缺。肠杆菌科、SCFAs和免疫系统特别是CD4+Tregs细胞的参与都是重要的因素之一。