海水胁迫对两种乌桕叶片保护系统的影响

张焕仕，宰学明，陈洋，何河，马艳，隋德宗

（1.金陵科技学院园艺园林学院，江苏 南京 210038；2.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153）

当前全球人口持续增长与耕地、淡水资源短缺之间的矛盾日益突出，而土壤盐渍化导致的粮食减产则成为一个困扰全球的难题［1］。据报道，全世界约25%的土地面积遭受盐渍化影响，中国盐渍化土地则达到3.6×107hm2，其中海滨盐土近2.0×107hm2，滩涂盐土面积为3.0×106hm2左右，且仍在不断扩展当中［2］。因此，选育能够较好地适应滨海盐碱地的耐盐植物对开发盐土资源和绿化造林有重要的研究和应用意义。特别是探明盐胁迫下耐盐植物的生理反应和耐盐机理，对于科学合理的指导耐盐植物栽培种植，改良盐碱地，充分开发其在沿海滩涂的经济价值具有重要意义。

乌桕［Sapium sebiferum（L.）Roxb.］，又称蜡子树、木油树、木梓树等，为大戟科（Euphorbiaceae）乌桕属（Sapium）落叶乔木，是原产我国的重要油料作物，广泛分布于我国大部分省、市、自治区。乌桕既有园林观赏价值，又有较高的经济价值。其根皮、树皮、叶等部位具有治疗头痛牙疼、清热解毒、通便消肿等功能［3］，还含有能除菌杀虫的活性成分，可以用于生产生物农药［4］；其籽粒含油量高达40%以上，而乌桕籽油可用于制造润滑剂、涂料、杀菌剂、高级燃料等［4］。其木材质地坚硬，可用于手工艺品、家具、雕刻和车辆等的选材［4］。在乌桕抗逆境胁迫生理机制方面，崔月和陈杰［5］研究了山乌桕对盐胁迫的生理指标响应状况，发现NaCl浓度达到0.4%时，山乌桕的耐盐性达到最高，属于中度耐盐树种。金雅琴等［6-7］研究了盐胁迫对乌桕幼苗光合特性、叶绿素含量、质膜相对透性、脯氨酸及可溶性糖含量等的影响。刘珊等［8］研究了圆叶乌桕幼苗对干旱胁迫的生理响应机制。张振［9］比较了入侵乌桕种群和原产地种群在根系形态和生理酶活性以及其根系的抗菌活性方面的差异。海滨晚霞乌桕和海滨紫晶乌桕是江苏省林业科学研究院选育的两个乌桕新品种，本课题组前期已研究了该系列乌桕新品种在NaCl胁迫下的植株生长量、存活率、细胞膜透性、叶绿素含量和光合参数等指标的变化，发现该系列乌桕对盐胁迫有一定的耐受度［10］。截至目前，未见到关于海滨晚霞和海滨紫晶乌桕叶片渗透调节物质与保护系统在盐胁迫下的生理反应的报道。

本研究以两年生海滨晚霞和海滨紫晶乌桕盆栽苗为研究对象，采用不同浓度海水对盆栽苗进行浇灌处理，测定不同处理时间下不同浓度海水处理的乌桕叶片保护系统指标，以揭示海滨晚霞和海滨紫晶乌桕对盐碱环境的适应对策，为滨海盐碱地耐盐乌桕资源选育与造林绿化提供重要理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

两年生海滨晚霞和海滨紫晶乌桕扦插盆栽苗由江苏省林业科学研究院种质资源圃提供，选取长势较为一致、生长健壮且无病虫害的植株备用。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

于2021年4月将海滨晚霞和海滨紫晶乌桕苗分别移栽至花盆中，花盆规格为48 cm×42 cm×37 cm，每盆栽用土量为0.07 m3。土壤基质由黄土、草炭土、珍珠岩和市售有机肥按照体积比20：3：3：2混合而成，每盆1株，移栽后置于金陵科技学院实验楼天桥处进行露天管理，保持土壤不缺水，树体无病虫害。7月3日选取生长状况基本一致的乌桕移至光照培养室进行海水胁迫处理。

原始海水采自江苏省东台市条子泥海湾（盐度为34.0‰），分别将海水稀释成9%（实际盐度0.31%）和15%（实际盐度0.51%）两个浓度梯度，以自来水处理为对照（CK），每个乌桕品种各三个处理，共计六个处理。采取随机区组试验设置，每个处理5个重复，共计30盆。每盆浇对应浓度海水溶液或自来水1000 mL，在花盆下放置托盘，将渗透到托盘的水分再重新浇灌到花盆中。在试验期间不对乌桕进行浇水，以保证海水胁迫浓度不变。培养室日间光照16 h（光强15000 lx），温度28℃（日）/18℃（夜），相对湿度65%～85%。

1.2.2 测定指标及方法

分别于不同浓度海水胁迫处理后的4 h，8 h，12 h，24 h在植株的上中下部摘取叶片，迅速带回实验室，用自来水将叶片冲洗干净，并用纱布吸干叶片表面水分，之后采取硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量；采取茚三酮法测定脯氨酸（Proline，Pro）含量；采取氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性；采取愈创木酚法测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性；采取钼酸铵法测定过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性［11］。

1.2.3 统计分析

采用Excel 2019和SPSS 21.0软件对试验数据进行统计、方差分析、相关性分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 海水胁迫对乌桕叶片Pro含量的影响

由图1A可知，随着海水浓度增高，海滨晚霞乌桕叶片Pro含量显著升高，然后随着处理时间的延长，Pro含量呈现出先降低后升高的总体变化趋势。在盐胁迫处理初期（4 h），与对照相比，海水处理下乌桕叶片Pro含量显著升高（P＜0.05），但9%与15%海水处理的Pro含量之间没有显著性差异（P＞0.05）。当处理达到8 h时，三种处理下的Pro含量都下降到了最低值，但两种海水浓度处理的Pro含量均显著高于对照处理（P＜0.05）。随着处理时间的延长，不同海水浓度处理的叶片中Pro的含量均不断升高，并都在24 h时达到了最高含量，9%与15%海水处理的Pro含量之间没有显著性差异，但均显著高于对照处理（P＜0.05）。

图1 海水胁迫对乌桕Pro含量的影响Fig.1 Effect of seawater stress on proline contents in S.sebiferum

由图1B可知，海滨紫晶乌桕叶片Pro含量随着处理时间的延长，呈现出先升高后下降的趋势。其中，对照与15%海水处理的Pro含量先呈升高趋势，在8 h后急剧下降，而9%海水处理的Pro含量在12 h达到最高值，并在12 h后出现下降。在盐胁迫处理初期（4 h）和8 h时，对照与15%海水处理的Pro含量都显著高于9%海水处理（P＜0.05），而在12 h和24 h时，两者的Pro含量又显著低于9%海水处理（P＜0.05）。

2.2 海水胁迫对乌桕叶片SOD活性的影响

通过不同浓度海水胁迫处理发现，胁迫导致海滨晚霞鸟桕叶片SOD活性降低，并随胁迫时间延长呈现出先增加后降低的总体变化趋势（图2A）。9%与15%海水处理的SOD活性分别在8 h时达到最高活性，然后随着处理时间延长，SOD活性逐步降低。9%海水处理的SOD活性在4 h和8 h时与对照相比没有显著性差异（P＞0.05），当处理12 h和24 h时则显著低于对照处理（P＜0.05），而15%海水处理的SOD活性则从处理初期到末期（24 h）一直显著低于对照处理（P＜0.05）。

图2 海水胁迫对乌桕SOD活性的影响Fig.2 Effect of seawater stress on SOD activities in S.sebiferum

由图2B可知，不同处理的海滨紫晶叶片SOD活性随着处理时间延长总体呈下降的趋势，不同浓度海水胁迫导致SOD活性降低。9%海水处理的SOD活性在8 h时达到最高活性，然后随着处理时间的延长，活性逐步降低，且一直显著低于对照处理（P＜0.05），在8 h和24 h时也显著低于15%海水处理。15%海水处理的SOD活性虽然在8 h时短暂提高至与对照没有显著差异，但其他处理时间的活性显著低于（P＜0.05）或低于对照处理。

2.3 海水胁迫对乌桕叶片POD活性的影响

由图3A可知，不同浓度海水处理下，海滨晚霞乌桕叶片POD活性呈现出先增加后降低的总体变化趋势，且海水胁迫导致POD活性显著提高（P＜0.05）。9%与15%海水处理的POD活性分别在8 h时达到最高活性，然后随着处理时间的延长，POD活性逐步降低，在24 h时降到最低活性。除了24 h，这两个浓度的海水处理的POD活性在其他处理时间都显著高于对照处理（P＜0.05），但这两个处理之间没有显著性差异（P＞0.05）。

由图3B可知，不同浓度海水处理下，海滨紫晶乌桕叶片POD活性呈现出先下降后升高的总体变化趋势，且海水胁迫导致POD活性在处理4 h至12 h时显著低于对照处理（P＜0.05），在24 h时又提高至显著高于对照处理（P＜0.05）。9%海水处理的POD活性在处理24 h时显著高于15%海水处理（P＜0.05），在处理4 h至12 h时没有显著性差异（P＞0.05）。

图3 海水胁迫对乌桕POD活性的影响Fig.3 Effect of seawater stress on POD activities in S.Sebiferum

2.4 海水胁迫对乌桕叶片CAT活性的影响

由图4A可知，不同浓度海水胁迫处理下的海滨晚霞乌桕叶片CAT活性随着处理时间的延长呈现不同的变化趋势，并且显著高于对照处理（P＜0.05）。9%海水处理的CAT活性初期缓慢提高，然后在12 h时下降到最低值，最后在24 h处理下达到最大活性。15%海水处理下，胁迫初期（4 h）其活性就急剧增加，但随着时间延长，其活性又持续下降，在24 h时下降到最低值，显著低于9%海水处理（P＜0.05）。

由图4B可知，不同浓度海水胁迫处理下的海滨紫晶乌桕叶片CAT活性随着处理时间的延长呈现不同的变化趋势。9%海水处理的CAT活性初期显著高于对照处理（P＜0.05），之后开始持续下降，在12 h时下降到最低值，但与对照处理没有显著差异（P＞0.05），然后又急剧提高，处理24 h时达到最大活性，显著高于对照和15%海水处理。15%海水处理下，胁迫初期（4 h）其CAT活性显著高于对照处理（P＜0.05），但随着时间延长，其活性呈先下降再升高，然后又降低的变化趋势，在处理12 h时达到最大活性，显著高于对照和9%海水处理（P＜0.05）。

图4 海水胁迫对乌桕CAT活性的影响Fig.4 Effect of seawater stress on CAT activities in S.sebiferum

2.5 海水胁迫对乌桕叶片MDA含量的影响

图5 A表明，不同浓度的海水胁迫处理导致海滨晚霞叶片MDA含量增加，9%与15%海水处理的MDA含量随时间延长呈现出先降低后升高的变化趋势，而对照处理则呈现出逐渐增大的趋势。海水处理4 h时，9%与15%海水处理的MDA含量显著高于对照处理（P＜0.05）。随着处理时间延长，对照处理的MDA含量持续增加，19%与15%海水处理的MDA含量先在8 h时下降到最小值，然后迅速升高，分别在24 h时达到峰值。在此过程中，虽然9%与15%海水处理的MDA含量高于对照处理，但都没有显著性差异（P＞0.05）。

图5 海水胁迫对乌桕MDA含量的影响Fig.5 Effect of seawater stress on MDA contents in S.Sebiferum

图5 B表明，在不同的胁迫时间下，不同浓度的海水胁迫处理之间海滨紫晶叶片MDA含量没有显著性差异（P＞0.05），只有15%海水处理的MDA含量在24 h时显著高于其他处理（P＜0.05）。对照与9%海水处理的MDA含量随时间延长不断增加，在12 h时达到最高值后又开始降低，而15%海水处理则呈现出先降低后升高的变化趋势。

2.6 海水胁迫下各生理指标的相关性分析

由表1相关性分析结果可知，乌桕叶片Pro含量与MDA含量呈显著负相关关系（P＜0.05），而与SOD活性和POD活性呈显著正相关关系（P＜0.05）；MDA含量与SOD活性呈显著负相关关系（P＜0.05），而与POD活性则呈极显著负相关关系（P＜0.01）；CAT活性与其他指标都不存在显著相关性；SOD活性和POD活性间存在着极显著相关关系（P＜0.01）。

表1 海水胁迫下乌桕叶片生理指标的相关性分析结果Tab.1 The correlation analysis of S.sebiferum physiological indexes under seawater stress

3 讨论与结论

当植物遭受盐胁迫时，其组织细胞外部渗透压降低，为防止内部水分渗出，并不断吸收环境中的水分，植物通过积累渗透调节物质来维持细胞内外渗透压平衡，以缓解盐胁迫导致的生理干旱［12-13］。Pro作为植物蛋白质的重要组分之一，是植物体内重要的渗透调节剂，溶解于细胞质中，能够有效降低细胞渗透势，发挥改善光合活性、保护抗氧化酶活性等作用，增强植物耐盐胁迫能力［14］。已有研究表明，在一定盐浓度范围内，细胞内Pro的积累与胁迫浓度呈正相关［15-16］。金雅琴等［7］研究认为，一定浓度的盐胁迫可以诱导乌桕叶片中游离脯氨酸含量的增加。本试验结果表明，海滨晚霞叶片中Pro含量随着海水浓度提高而显著增加，且随着处理时间的延长，呈现出先降低后升高的总体变化趋势。而海滨紫晶乌桕叶片中Pro积累量在低浓度海水（9%）处理初期（4～8 h）显著低于对照处理，然后随着处理时间的延长，Pro含量呈现出先升高后降低的总体变化趋势；而高浓度海水（15%）处理时Pro积累量在初期显著高于对照，然后在12 h后急剧下降。同时，相关分析表明Pro含量与MDA含量呈显著负相关关系（P＜0.05），与SOD活性和POD活性呈显著正相关关系（P＜0.05）。这说明两种乌桕都具有较强的抗盐胁迫能力，可在海水胁迫初期以较低的Pro含量维持细胞渗透势，而随着海水浓度增加和胁迫时间延长，可通过提高体内Pro含量达到降低细胞渗透势的目的，保护SOD活性和POD活性，以缓解细胞膜脂过氧化程度，减少MDA在叶片内的积累，降低盐胁迫对乌桕组织细胞的伤害。但超过一定盐胁迫浓度范围和胁迫时间，相较海滨晚霞乌桕，海滨紫晶乌桕可能就无法通过调整Pro含量以有效应对盐胁迫引起的伤害。这与崔月和陈杰［5］的研究结果基本一致：山乌桕叶片Pro含量在受到盐胁迫时极显著升高，但超过0.4%NaCl浓度时Pro则出现下降。

盐胁迫会引起植物产生大量超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（OH-）等活性氧（ROS），破坏细胞的正常生理代谢平衡，这将诱导植物产生SOD、POD和CAT等抗氧化酶以清除多余ROS，减轻ROS积累对植物的伤害［17］。SOD、POD和CAT可相互协作降低细胞内活性氧的积累，由SOD负责将ROS转化为O2和H2O2，POD和CAT再将SOD产生的H2O2转化为H2O和O2［18］。山乌桕叶片在0～0.4% NaCl浓度下SOD和POD活性先增高，在0.6%NaCl浓度下再降低［5］。徐千瑞等［17］研究表明，随着胁迫的持续进行，0.30%土壤含盐量处理组日本荚蒾植株叶片的SOD、POD活性及0.45%土壤含盐量处理组植株叶片的SOD活性也表现出先上升后下降的趋势［19］。徐涛等［20］研究表明，随着盐处理浓度和时间的增加，黄薇体内的SOD活性则呈现先上升后下降趋势。唐宁等［21］研究则发现，随着海水浓度的增加，秋葵POD活性呈升高趋势，CAT活性与SOD活性均呈先升高后降低的趋势。

本研究发现，随着海水处理浓度增加和胁迫时间延长，海滨晚霞叶片SOD和POD活性均呈现出先增加后降低的趋势，15%海水处理下的CAT活性随着时间延长持续下降，其SOD活性则从处理初期到末期（24 h）一直显著低于对照处理（P＜0.05）。与对照相比，无论高浓度海水还是低浓度海水处理都抑制了海滨紫晶乌桕SOD和POD活性，只有POD活性在处理24 h时显著高于对照。不同浓度海水处理下的CAT活性随着时间延长呈不同变化趋势，但总体上显著高于对照处理。相关性分析表明，MDA含量与SOD活性呈显著负相关关系（P＜0.05），而与POD活性则呈极显著负相关关系（P＜0.01）；CAT活性与其他指标都不存在显著相关性；SOD活性和POD活性间存在着极显著相关关系（P＜0.01）。这可能说明海滨晚霞乌桕在受到盐胁迫时主要通过提高POD活性以清除ROS，缓解盐胁迫对植物的伤害。而海滨紫晶可能主要通过提高CAT活性清除ROS，POD活性则在乌桕遭受长时间高浓度海水胁迫时才会被激发以参与抗氧化酶系统的ROS清除协作。同时，随着胁迫浓度和处理时间增加，海滨晚霞乌桕叶片细胞只能承受一定范围内的ROS积累，一旦超出其承受范围会造成细胞膜脂过氧化程度加深，降低其耐盐能力。这与徐千瑞等［19］和彭立新等［22］的研究结论是一致的。

研究表明，盐胁迫会损伤植物细胞膜系统，引起膜透性极大增加，致使膜脂过氧化，最终导致植物正常的生长发育受到抑制。MDA是膜质过氧化反应的最终产物，是衡量细胞膜损伤的最常用指标之一，其含量的高低可反映膜质过氧化程度和间接评价植物细胞膜的受损状况［23］。崔月和陈杰［5］研究发现，盐浓度达到0.4%时，山乌桕幼苗的MDA含量显著提高。金雅琴等［7］研究表明，乌桕叶片MDA的含量随土壤NaCl浓度升高而呈增加趋势，但都小于对照处理，说明盐溶液可降低MDA在乌桕组织体内的积累。与以上研究有所不同，本试验研究发现，海水胁迫处理导致乌桕叶片MDA含量增加，且9%与15%海水处理的海滨晚霞乌桕MDA含量在胁迫初期显著高于对照处理，然后随时间延长呈现出先降低后升高的变化趋势。而海滨紫晶叶片MDA含量经不同浓度海水胁迫处理在不同胁迫时间下没有显著性差异，只有高浓度（15%）海水处理的MDA含量在处理24 h后显著高于其他处理。相关性分析表明，MDA含量与SOD和POD活性则呈显著负相关。这说明海滨晚霞具备一定的耐盐胁迫能力，在受到盐胁迫时能够迅速启动体内的防御体系以保护细胞膜，减轻膜脂过氧化，但其耐盐能力又比较有限，导致高浓度海水胁迫对其细胞膜造成一定损伤，引起MDA含量随胁迫时间延长呈现先降低后升高的趋势。海滨紫晶则具备较强的耐盐胁迫能力，其在盐胁迫初期能维持MDA含量在较低水平，在受到高浓度海水长期胁迫时才会引起较严重的膜脂过氧化，表现出较高的MDA积累量。这也与我们前期研究发现四个乌桕新品种耐盐强弱顺序依次为：海滨紫晶＞海滨绯红＞海滨梦幻＞海滨晚霞的结果相一致［10］。

综上所述，海滨晚霞和海滨紫晶乌桕在不同海水浓度胁迫下都能够迅速启动体内的防御体系以保护细胞膜，减轻膜脂过氧化，但两种乌桕的叶片保护系统在抗盐胁迫过程又表现出了各自不同的特点。其中，随着海水浓度增加和胁迫时间延长，两种乌桕可通过提高体内脯氨酸含量达到降低细胞渗透势、保护SOD活性和POD活性的目的；海滨晚霞在受到海水胁迫时主要通过提高POD活性以清除ROS，海滨紫晶可能主要通过提高CAT活性清除ROS，以缓解海水胁迫对植物的伤害；海水胁迫导致两种乌桕叶片的MDA含量增加，相较海滨晚霞，海滨紫晶在受到高浓度海水长期胁迫时才会引起较严重的膜脂过氧化，表现出较高的MDA积累量。