基于气质联用法研究黄瑞香种子的化学成分

朱高，陈叶，杜涛非，闫芳，张春云，王海平，王建东，王家强，王恩军

（1.河西学院农业与生态工程学院，甘肃 张掖 734000；2.肃南明海林场，甘肃 张掖 734000；3.甘肃泰康制药有限责任公司，甘肃 武威 735000；4.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖 734000；5.祖师麻基源植物应用技术研究所，甘肃 张掖 734000）

黄瑞香（Daphne giraldiiNitsche）为瑞香科落叶小灌木，分布于甘肃、宁夏、陕西、青海等省区［1］。以茎皮和根皮入药，具有镇痛、抗炎、抗疟、抗肿瘤等功效［2］。黄瑞香为中药祖师麻的基源植物，现已被国家列为三级保护中药材［3］。而祖师麻是北方地区的民间药方，曾收录于《重修定西县志》中，特别在甘肃民间使用历史久远［4］。周光雄等［5］、廖时余等［6］从黄瑞香根、茎的皮中分离出香豆素类、黄酮类、木质素类、萜类等化合物；前人从黄瑞香的根茎中分离得到了20个香豆素类化合物，15个黄酮类化合物，13个木质素类化合物，二萜类化合物和三萜类化合物［7-10］，但未见有关黄瑞香种子内有机物的报道，因此采用GC-MS法对黄瑞香种子内有机化合物成分进行了分析研究，可为更好地合理利用黄瑞香资源提供科学依据。

1 仪器与材料

Trace GC200气相色谱仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；TraceDSQ和TraceGC2000气质联用分析仪（美国菲尼根质谱公司）；JY10001电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；KDW调温电热套1000 mL（山东城华鲁电热仪器有限公司）；石油醚、乙醚、乙酸乙酯及甲醇均为分析纯。黄瑞香种子采集于武威市天祝县祁连乡布尔草原（103°33＇26″E，38°43＇31″N），共得1700 g净种子，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为黄瑞香种子。

2 方法

2.1 种皮、胚中的有机物提取

从采集的黄瑞香种子中选择饱满种子，将种皮和胚分开，各称取500 g。用研钵磨碎后置于烧杯中，分别加入80%的甲醇500 mL浸提（4℃下），每隔3 h搅拌一次。24 h后用布氏漏斗过滤，收集滤液；将滤渣重新加入500 mL 80%的甲醇继续多次浸提至近无色为止，合并其滤液，低温保存备用。

2.2 种皮和胚的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相及甲醇相提取物的制备

采用系统溶剂法将所得的浸提液分别在35℃下减压浓缩，离心（4000 r/min）20 min后，取上清液用石油醚萃取3次，得到石油醚相；将所得水相用乙醚萃取3次，得到乙醚相；将所得水相用乙酸乙酯萃取3次，得到乙酸乙酯相；将所得水相在65℃减压蒸干后，用甲醇溶解过滤，得到甲醇相［11］。将各有机相定容至200 mL，置于冰箱中（5℃）保存。

2.3 样品检测

GC-MS分析条件：气相色谱条件见参考文献；DB-5石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温35℃稳定4 min，以5℃/min程序升温至90℃，再以8℃/min程序升温至240℃稳定2 min，传输线250℃；载气为高He（99.99%），气化室温度为250℃；质谱条件：电子能量70 eV，电离方式EI；离子源200℃；扫描范围29～550 u。利用气质联用仪计算机的谱库检索各组分的质谱数据，并参考NIST（2008）等有关标准图谱进行核对和补充检索，用色谱峰面积归一化法计算各色谱峰占挥发油总量的相对含量。

3 结果与分析

3.1 黄瑞香种子种皮提取的有机物种类

将提取的种皮石油醚相浓缩样品进行气谱-质谱联用仪分析，得到总离子流程峰值（见图1）。经计算机质谱系统检索，将样品的质谱图与标准谱图进行核对，鉴定出相似度和相对含量较大的6种有机物（见表1），分别为亚油酸（30.42%）、柠檬酸三丁酯（27.6%）、辛烷（13.8%）、邻苯二甲酸二丁酯（7.1%）、棕榈酸甲酯（3.82%）和乙酰柠檬酸三丁酯（2.4%）［11］，6种有机物占总峰面积的85.14%。

图1 黄瑞香种皮石油醚相总离子流程图Fig.1 The total ion flow chart of petroleum ether extract solution of D.giraldii seed spermoderm

表1 黄瑞香种皮各相浸提液的有机物种类Tab.1 The kinds of organics in D.giraldii seed spermoderm with various phase extract solutions

将种皮的乙醚相浓缩样品经气谱-质谱联用仪分析后，其总离子流程峰值如图2所示。经计算机质谱系统检索，质谱图与标准谱图进行核对，鉴定出的有机物为：邻苯二甲酸二丁酯（40.77%）、瑞香素（12.43%）、油酸酰胺（11.65%）、豆甾醇（7.59%）和十八烷（3.37%），有一物未鉴定出，占8.03%［11］（表1）。主要有机物的相对含量占总峰面积的83.84%。

图2 黄瑞香种皮乙醚相总离子流程图Fig.2 The total ion flow chart of aether extract solution of D.giraldii seed spermoderm

用气谱-质谱联用仪将种皮的乙酸乙酯相样品分析，其总离子流程中鉴定出峰面积较大的有机物有8种（图3）：邻苯二甲酸二丁酯（40.64%）、亚油酸（15.93%）、十六甲基环辛硅氧烷（8.89%）、十四甲基环七硅氧烷（6.53%）、柠檬酸三乙酯（5.91%）、硬脂酸（5.63%）、醋酸（4.85%）和丙酸乙酯（2.91%）［11］（表1）。相对含量占总峰面积的91.29%。

图3 黄瑞香种皮乙酸乙酯相总离子流程图Fig.3 The total ion flow chart of ethyl acetate extract solution of D.giraldii seed spermoderm

经气谱-质谱联用仪分析种皮的甲醇相浓缩样品，总离子流程分离出14个明显的峰（图4）。鉴定出相对含量较多、相似度高的有机物10种（表1）：5-羟 甲 基 糠 醛（11.67%）、乙 酸（9.1%）、瑞 香 素（8.87%）、吡喃酮（8.52%）、邻苯二甲酸二丁酯（7.26%）、油酸（3.14%）、糠醛（3.69%）、丙三醇（2.88%）、羟基丙酮（2.84%）和糠醇（2.54%）［11］。相对含量占总峰面积的60.51%。

图4 黄瑞香种皮甲醇相提取物的总离子流程图Fig.4 The total ion flow chart of methanol extract solution of D.giraldii seed spermoderm

3.2 黄瑞香种胚中提取的有机物种类

经气谱-质谱联用仪分析黄瑞香种胚的石油醚相浓缩样后，得到了8个峰值（图5）。鉴定出的有机物有：邻苯二甲酸二丁酯（33.85%）、甲基环己烷（20.17%）、庚烷（14.81%）、亚油酸（12.61%）、棕榈酸甲酯（4.16%）和辛烷（3.15%）［11］（表2）。含量为总峰面积的88.75%。

图5 黄瑞香种胚石油醚相提取物的总离子流程图Fig.5 The total ion flow chart of petroleum ether extract solution of D.giraldii seed embryo

经气谱-质谱联用仪分析种胚的乙醚相浓缩样品后，在总离子流程中得到8个峰（图6）。鉴定出主要的有机物（表2）有：邻苯二甲酸二丁酯（24.07%）、亚油酸（13.33%）、苯甲酸（9.82%）、未知3（7.68%）、油酸酰胺（5.13%）和肉桂酸（2.06%）［11］，含量为总峰面积的62.09%。

图6 黄瑞香种胚乙醚相提取物总离子流程图Fig.6 The total ion flow chart of aether extract solution of D.giraldii seed embryo

经气-质谱联用仪分析黄瑞香种胚的乙酸乙酯相浓缩样，得到的总离子流程（图7），得到6个峰。鉴定出有机物：邻苯二甲酸二丁酯（22.89%）、柠檬酸三乙酯（6.38%）、亚油酸（5.97%）、丙酸乙酯（2.11%）和乙酸丁酯（0.26%）［11］（见表2）。这些物质主要为酯类和有机酸类物质，含量为总峰面积的37.61%。

图7 黄瑞香种胚乙酸乙酯相提取物的总离子流程图Fig.7 The total ion flow chart of ethyl acetate extract solution of D.giraldii seed embryo

经气谱-质谱联用仪分析种胚所提取的甲醇相浓缩样品后，从总离子流程中分离出8个峰（图8）。经鉴定有机物主要有6种（表2）：5-羟甲基糠醛（10.77%）、邻苯二甲酸二丁酯（7.23%）、2，3-二氢-3，5二羟基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮（6.79%）、呋喃酮（2.28%）、3-糠醛（1.40%）和甲基环戊烯醇酮（1.23%）［11］。主要为酮类、醛类物质和酯类物质，含量为总峰面积的29.70%。

表2 黄瑞香种胚各相浸提液的有机物种类Tab.2 The kinds of organics in D.giraldii seed embryo with various phase extract solutions

图8 黄瑞香种胚甲醇相提取物的总离子流程图Fig.8 The total ion flow chart of methanol extract solution of D.giraldii seed embryo

4 结论与讨论

经GC-MS分析和计算机质谱系统检索核对，结果表明，种皮中共有25种有机物，鉴定出23种，未鉴定出的有2种，其中质量分数较高的有邻苯二甲酸二丁酯、柠檬酸三丁酯、油酸酰胺、亚油酸、瑞香素、辛烷和5-羟甲基糠醛；在种胚中鉴定出了18种有机物，未鉴定出的有机物有1种，其中质量分数较高的有邻苯二甲酸二丁酯、甲基环己烷、亚油酸、苯甲酸、肉桂酸和5-羟甲基糠醛。本实验鉴定的黄瑞香种子中共有32种有机物，其中质量分数较高的有机物有邻苯二甲酸二丁酯、亚油酸、柠檬酸三丁酯、瑞香素、甲基环己烷、油酸酰胺、辛烷、庚烷、5-羟甲基糠醛。有机物主要以酯类、有机酸类、烃类、醛酮类和醇类为主。且种皮和种胚中的共有组分和专一组分差异较大，种皮中的有机物种类多于种胚。

廖时余等［6］从黄瑞香茎皮中分离得到7个化合物，分别鉴定为正丁基丁香苷、β-香树脂酮、β-谷甾醇棕榈酸酯、β-香树脂醇乙酸酯、瑞香多林A、狼毒双香豆素、木犀草素。与本实验相比除均含香豆素类外，其它成分则为专一组分；苏娟等［9］从黄瑞香根中分离鉴定出了β-谷甾醇、胡萝卜苷、齐墩果酸、十八碳酸单甘油酯、十八烷基咖啡酸酯、白桦酸、瑞香素、齐墩果瑞香醛等10个化合物，除与本实验均含共有组分瑞香素外，其它均为专一组分；而张和平等［10］从黄瑞香叶中分离出3-己烯-1-醇、顺式-α，α，5-三甲基-5-四氢呋喃-2-甲醇、天然壬醛、十六烷、二噻吩乙酸、3-三癸酯、柏木脑等化学成分，与本实验的成分无一类同，这可能与不同部位次生代谢产物的转运和积累相关。最为关键的是种子中含有大量的有机酸、酮类化合物、酯类、亚油酸、瑞香素和5-羟甲基糠醛，Abdul等［12］发现有机酸、酮类化合物和酯类能增强抗炎和镇痛效力；张春娥等［13］认为亚油酸能降胆固醇，预防动脉粥样硬化等功效；瑞香素又名祖师麻甲素，是香豆素类化合物的代表性单体成分，为我国首创的心脑血管新药，且有多种药理作用［14］，Liu等［15］认为瑞香素对胰腺炎有控制作用，且其抗氧化活性突出［16］，Du等［17］发现瑞香素通过抑制坐骨神经损伤小鼠L4-6脊髓中NF-6激活，促进坐骨神经再生及功能恢复；5-羟甲基糠醛具抗氧化［18］，改善血液流变学［19］等药理作用。这些活性成分在种子中含量高，是潜在的药用资源，故应研究开发。

黄瑞香以茎皮和根皮入药，核心成分是瑞香素，而在获得原料时，常采用砍伐枝条和挖根，对资源和生态破坏极大，这也是该资源面临濒危的主要因素。本试验首次从种子中发现了独特成分-瑞香素，且只存在于种皮，本发现将为核心成分的获取开辟新路径，为此，可通过收获较多的种子来获取“靶标”物，同时为频危资源的保护和繁延起到积极的影响。种皮特性可引种子的休眠［20-21］，而黄瑞香种子的休眠是否与种皮的主要物质相关，有待于今后进一步研究。