南酸枣果皮提取物的抗过敏活性及其在化妆品中的应用研究

聂韡，单承莺，刘薇，束成杰，马世宏

（南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京，211111）

随着人们生活节奏的加快、工作压力的增大以及饮食结构的变化，过敏性人群快速增长。据不完全统计，过敏病患已占世界人口五分之二［1］，在全球范围内，自我感觉为过敏性肌肤的人群越来越多，皮肤过敏已经成为影响人类健康的社会问题，具有抗敏功效的化妆品日益受到人们的重视，也是学者们研究的热点问题。天然抗敏剂从天然植物中提取，在安全性方面远远好于其它化学合成剂，尤其受到学者和市场的青睐。开发含有独特功效的天然抗敏活性物质，将其添加到化妆品中，研制天然抗敏化妆品，已成为化妆品产业发展最活跃的主题之一。

南酸枣［Choerospondias axillaris（Roxb.）Burtt et Hill（Spondias axillaris Roxb.）］为漆树科（Anacardiaceae）南酸枣属植物，又名山枣子、五眼果、四眼果、酸枣树、货郎果、连麻树、鼻涕果，是蒙药习用药材，主要应用于临床治疗与心脏相关的疾病［2］。研究发现，南酸枣果实中含有丰富的黄酮、多酚、皂苷、单宁等生物活性成分［3-4］。近年来，对南酸枣的综合开发利用主要集中在食品方面，以南酸枣果肉为原料制备南酸枣糕、南酸枣果酱等，市场销量非常大，而在大量生产南酸枣食品的过程中南酸枣果皮作为废弃物被大量抛弃，造成南酸枣资源的极大浪费，同时也极其不环保。为了更加全面综合地利用南酸枣资源，扩大南酸枣的应用范围，提高南酸枣的附加值；同时也为了发掘更多的天然抗敏剂，本文选取南酸枣果皮为原料，提取活性组分，并通过体内和体外试验评价了南酸枣果皮提取物的抗过敏活性，以期为其在抗敏化妆品方面的应用提供理论依据和指导。

1 试验部分

1.1 主要材料、试剂与仪器

南酸枣果皮，由江西省林业科学院提供，经烘干粉碎后备用。

试剂：十二烷基硫酸钠、无水乙醇、甘草酸二钾、透明质酸酶、透明质酸钠、对-二甲氨基苯甲醛、冰乙酸、乙酸钠结晶、无水氯化钙、氢氧化钠、浓盐酸、乙酰丙酮、磷酸氢二钠、氯化钠、亚硝酸钠、硝酸铝，均购自国药集团化学试剂有限公司。

茶多酚、芦丁标准品均购自中国药品生物制品检定所。扑尔敏购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

仪器：UV2550紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；FA-1004N电子分析天平（上海名桥精密科学仪器有限公司）；H/T16MM台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；肤色测量仪（芬兰Delfin Technologies）。

1.2 试验方法

1.2.1 南酸枣果皮提取物的制备［5-6］

取干燥粉碎后的南酸枣果皮粉末100 g，加入50%乙醇水溶液（料液比1：20 g/mL），以及100 g十二烷基硫酸钠辅助超声提取，超声功率600 W，超声温度40℃，超声时间20 min，提取2次，过滤，合并滤液，滤液减压回收去除溶剂中的乙醇，得到南酸枣果皮的粗提液。粗提液经D101型大孔吸附树脂纯化，先用30%乙醇水溶液洗脱去除水溶性杂质后，收集50%浓度的乙醇水洗脱液，洗脱液减压浓缩后干燥得到南酸枣果皮提取物。

1.2.2 南酸枣果皮提取物的总黄酮含量测定［7］

1.2.2.1 对照品溶液的制备

精密称量芦丁对照品40 mg，置于小烧杯中，加少量无水乙醇溶解，后转移至50 mL棕色容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，即得0.8 mg/mL的芦丁标准品溶液。

1.2.2.2 标准曲线的制备

精密量取芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于25 mL棕色容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，静 置5 min，再 加 入10% Al（NO3）3溶 液1.0 mL，静置6 min，最后加入4%NaOH溶液10 mL，摇匀后加入70%乙醇定容至刻度，暗处静置20 min。于510 nm波长下测定吸光度值（A），同时做空白对照试验，以芦丁质量浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.4352x-0.0046，R2=0.9931。当待测样品的浓度范围在0.02～0.12 mg/mL时呈现良好的线性关系。

1.2.2.3 样品测定

精密称取南酸枣果皮提取物50 mg，加入70%乙醇25 mL溶解，摇匀，过滤备用。

1.2.3 南酸枣果皮提取物的透明质酸酶抑制活性测定［8］

透明质酸酶溶液和透明质酸钠溶液的配制：量取1155 μL冰乙酸稀释至100 mL，取4.8 mL为A溶液，称取2.72 g乙酸钠结晶加水溶解定容至100 mL，取45.2 mL为B溶液，混合溶液A与B并以水定容至100 mL，制成pH=5.6的醋酸缓冲液；用配制好的醋酸缓冲液作为溶剂配制透明质酸酶溶液和透明质酸钠溶液（两种溶液的最终工作浓度为1250 U/mL和0.5 mg/mL）。

乙酰丙酮溶液的配制：在50 mL碳酸钠溶液（1.0 mol/L）中加入3.5 mL乙酰丙酮配制而成。

埃尔利希试剂的配制：称取0.8 g对-二甲氨基苯甲醛溶于15 mL浓盐酸和15 mL无水乙醇中配制成埃尔利希试剂。

采用透明质酸酶体外抑制试验法进行，取0.1 mL 0.25 mmol/L氯化钙溶液和透明质酸酶溶液保温培养20 min；加入样品液0.5 mL，继续37℃保温培养20 min；加入0.5 mL透明质酸钠溶液保温30 min，常温放置5 min；加入0.1 mL 0.4 mol/L氢氧化钠溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置沸水浴中加热15 min后立即用冰水冷却5 min；加入埃尔利希试剂1.0 mL并用3.0 mL无水乙醇进行稀释，放置20 min显色，用分光光度计测定其吸光度值。透明质酸酶抑制率计算公式如下：

其中，A为对照溶液吸光度（用醋酸缓冲溶液代替样品溶液），B为对照空白溶液吸光度（用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液），C为试样溶液吸光度值，D为试样空白溶液吸光度（用醋酸缓冲溶液代替酶液）。

1.2.4 抗敏精华乳的制备

制备工艺：按照表1的配方比例，将环戊硅氧烷，辛酸癸酸三甘油酯和生育酚醋酸酯混合，得第一混合物A相；将甘油，1，3-丁二醇，D-泛醇，乙二胺四乙酸二钠，汉生胶，尿囊素、十六烷基磷酸酯钾和去离子水在85℃条件下，搅拌均匀，得第二混合物B相；将第一混合物A相倒入第二混合物B相，均质，倒入聚丙烯酰胺C相搅拌均匀，冷却至50℃左右，依次加入南酸枣果皮提取物，香精，二羟基二甲基乙内酰脲D相搅拌均匀，静置，冷却，灌装。

表1 抗敏精华乳的配方比例Tab.1 Formula proportion of anti-allergy essence milk

1.2.5 抗敏精华乳的人体抗敏功效评价

1.2.5.1 镇静皮肤效果［9］

实验选择按GB17149-1997（化妆品皮肤病诊断标准及处理原则）诊断无相关化妆品皮肤病志愿者30名。通过10%十二烷基硫酸钠溶液贴片（面积：2 cm×2 cm）刺激上臂内侧皮肤，在十二烷基硫酸钠刺激皮肤后，立即涂用抗敏精华乳和空白精华乳30 min后观察皮肤症状。结果判定依据见表2。

表2 结果判断依据Tab.2 Basis of result judgment

1.2.5.2 减轻皮肤红肿效果［10］

实验选择按GB17149-1997（化妆品皮肤病诊断标准及处理原则）诊断无相关化妆品皮肤病志愿者30名。采用1.0%的辣椒素刺激皮肤红肿，在1.0%的辣椒素刺激皮肤后，立即涂用抗敏精华乳和空白精华乳，通过肤色测量仪（Delfin Skincolorcatch）测试30名志愿者皮肤在不同时期的红斑值E的平均值，计算皮肤红斑相对消退率，反映皮肤红肿现象的变化。

其中，初始红斑值E表示辣椒素刺激皮肤后红斑值E；测量红斑值E表示涂用精华乳一定时间后的红斑值E。

2 结果与讨论

2.1 南酸枣果皮提取物总黄酮含量测定

参照1.2.2中的方法，计算出南酸枣果皮提取物中总黄酮的含量为73%。

2.2 南酸枣果皮提取物体外透明质酸酶抑制活性

配制浓度为0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、10.0%的南酸枣果皮提取物溶液，按照1.2.3的方法测定透明质酸酶抑制活性，以甘草酸二钾为阳性对照，结果如图1所示，南酸枣果皮提取物和甘草酸二钾对透明质酸酶均具有抑制作用，且抑制率随着样品浓度的增加随之上升，在浓度较低时，南酸枣果皮提取物比相同浓度下的阳性对照甘草酸二钾的透明质酸酶抑制率要低；随着浓度的增加，南酸枣果皮提取物对透明质酸酶的抑制作用逐渐接近于甘草酸二钾，当浓度超过5.0%后，南酸枣果皮提取物对透明质酸酶的抑制作用甚至高于阳性对照甘草酸二钾。试验结果证明，南酸枣果皮提取物是一种具有显著抗敏活性的天然植物原料。

图1 不同浓度南酸枣果皮提取物和甘草酸二钾对透明质酸酶抑制作用Fig.1 Inhibitory effects of different concentrations of Choerospondias axillaris peel extract and dipotassium glycyrrhizinate on hyaluronidase

2.3 抗敏精华乳的人体抗敏功效分析

2.3.1 镇静皮肤的效果分析

由表3可以看出，通过十二烷基硫酸钠刺激皮肤后，分别涂用3款抗敏精华乳以及空白精华乳，30 min后皮肤不适症状的消除率具有显著区别。其中涂抹抗敏精华乳I的30名志愿者中有28名皮肤不适的临床表现完全消失，仅有2名还有微弱红斑的现象；抗敏精华乳II的试用志愿者中有19名皮肤不适的临床表现完全消失；抗敏精华乳III的试用志愿者中有13名皮肤不适的临床表现完全消失；而空白精华乳的试用志愿者中仅有9名皮肤不适的临床表现完全消失。由试验结果可判断，本发明制备的含有南酸枣果皮提取物的抗敏精华乳具有显著的皮肤镇静效果，且和南酸枣果皮提取物的添加量呈现正相关。

表3 不同抗敏精华乳对皮肤刺激的影响Tab.3 Effects of different anti-allergy essence milk on skin irritation

2.3.2 减轻皮肤红肿的效果分析

由表4可以看出，辣椒素刺激后皮肤会发生明显红肿。涂抹含不同剂量南酸枣果皮提取物的抗敏精华乳后，皮肤的红肿现象消退明显，在60 min左右，抗敏精华乳I对皮肤红斑消退率达到85.9%，抗敏精华乳II对皮肤红斑消退率达到76.1%，抗敏精华乳III对皮肤红斑消退率达到59.4%；而作为对照的空白精华乳，其红肿120 min左右红斑消退率才达到42.9%。上述数据说明含有南酸枣果皮提取物的抗敏精华乳可以有效消除因外界刺激造成的皮肤表面泛红现象。

表4 不同抗敏精华乳减轻红肿结果Tab.4 Results of reducing redness and swelling with different anti-allergy essence milk

3 结论与展望

本文试验结果显示，当南酸枣果皮提取物质量浓度为5%时，对透明质酸酶的抑制率可达到90%。进一步实验结果表明，将南酸枣果皮提取物用作化妆品功效原料，添加1%～5%的南酸枣果皮提取物，即可对皮肤产生显著的镇静效果，亦可有效消除因外界刺激造成的皮肤表面泛红现象。本文的研究将南酸枣废弃的果皮再利用，得到的南酸枣果皮提取物可作为潜在的抗敏化妆品原料，极大提高了南酸枣的利用附加值，进一步拓展了南酸枣的应用领域。