1,2,4-三氯苯对斑马鱼及其胚胎发育的影响研究

辛建珍

（清远市清环检测技术有限公司，广东 清远 511500）

1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）是一种具有高沸点的有机物，被广泛应用于医药、农药、染料等产业[1]，目前已在环境中广泛检出[2]。该物质对人体具有较强的致癌、致畸、致突变作用[3]。常年产卵的斑马鱼个体小（体长4～5 cm），饲养方便简单，产卵量大且易于收集，其早期发育阶段对外界环境敏感，是毒性试验的常用模式生物。直接暴露于1,2,4-TCB 中的成年斑马鱼容易受到损伤，对其胚胎进行染毒能够避免对其母体的伤害，能更直观地观察到胚胎的发育毒性效应。本试验主要研究不同浓度的1,2,4-TCB对斑马鱼的毒性效应，并通过卵凝结、孵化率和畸形率等毒理学终点指标观察其对斑马鱼胚胎发育的影响。

1 试验方法与材料

1.1 受试生物与试剂

采用反应灵敏、外观正常、体态均匀（体长3.25 cm±0.35 cm）的健康成年斑马鱼作为受试对象。斑马鱼购于广州市芳村市场，置于室内水族箱中进行驯养，驯养7 d 后试验，试验前一天断食。主要试剂有1,2,4-TCB 和丙酮（分析纯），所用试剂均为市售有证合格试剂。

1.2 测试终点及指标

目前，斑马鱼及其胚胎染毒时间主要集中在4～48 h，可以观察的毒理学终点包括卵凝结、囊胚发育、外包活动阶段、原肠胚终止、胚孔关闭、体节数、尾部延伸、20 s 内主动活动、眼点发育、心跳、血液循环、黑色素细胞、耳石的发育，48 h 后（不超过72 h）主要观察心率、孵化率和畸形率等。其间主要涉及Ⅰ类、Ⅱ类两类指标，代表致死性的Ⅰ类指标包括卵凝结、不开始原肠胚作用、原肠胚作用不终止、无体节、尾部无延伸、无心跳、48 h 后无主动运动、不孵化等，揭示化合物特定作用方式（非致死性指标）的Ⅱ类指标包括体节数显著减少、无血液循环、眼点不发育、24 h 后无主动运动、各种畸形、孵化延迟等。

1.3 试验方法

定量1,2,4-TCB 用丙酮助溶后（丙酮的体积分数不超过1%）[4]，用双蒸水配制成浓度1 000 mg/L 的储备液备用，使用时稀释到所需浓度。

1.3.1 斑马鱼毒性试验

采用半静态试验法，急性毒性试验按照资料[5-6]所述方法进行。试验用水为曝气48 h 后的自来水，试验器皿为规格25 cm×18 cm×25 cm 的小水族缸。量取2 L 药液置于每个水族缸中，根据等对数间距设计5 个浓度组（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L）[7]，同时做1 个对照组、1 个助溶剂组和1个平行组。每个组别放入10 尾受试斑马鱼。随时捞出死亡受试鱼，试验期间不可喂食斑马鱼，每3 d 更换一次水，试验周期为9 d，每天观察一次，并记录致死率，观察其中毒症状。应用概率单位法计算，得到暴露各时间的半致死浓度（LC50）及其95%置信区间[8]。

1.3.2 斑马鱼胚胎体外染毒

以3 ∶2 的雌雄比例，将产卵期的斑马鱼放在孵化器中，待其产卵。捞出鱼卵，用去离子水冲洗鱼卵3次，然后用显微镜分辨受精卵、未受精卵，选取正常分裂受精卵。为了与斑马鱼毒性试验对比，设置一致的浓度梯度组（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L）、对照组、平行组，另设一助溶剂组（1,2,4-TCB 浓度20 mg/L，丙酮体积分数0.8%）。用洁净培养皿作为斑马鱼胚胎体外染毒试验容器，每组培养皿中放入20 mL 试液，并放入20 枚约孵化3 h的囊胚期受精卵，置于室温下培养。从斑马鱼产卵开始计时，每4 h 记录一次情况，并记录发育过程中的毒理学终点[9-11]。

1.3.3 斑马鱼胚胎体内染毒

将之前处理9 d 后所剩的斑马鱼捞出并放置于清水中。由于高浓度（15 mg/L、20 mg/L）组处理的斑马鱼全部死亡，剩下3 个浓度组（1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）和1 个对照组的斑马鱼。待剩下的3 个浓度组斑马鱼产卵，捞出鱼卵，用去离子水冲洗3次，用显微镜区分受精卵与未受精卵，选取正常分裂的受精卵。每组有20 枚受精卵，室温培养，做两组。从鱼产卵时开始计时，每4 h 观察一次，并记录发育过程中的毒理学终点[12-14]。

2 结果与讨论

2.1 斑马鱼急性毒性试验

试验浓度量的丙酮对斑马鱼没有影响，但是斑马鱼对1,2,4-TCB 的毒性表现非常敏感，在高浓度时，鱼立即表现出中毒症状，如烦躁、乱窜、局促不安、剧烈运动、跳动、侧游，而后运动速度逐渐减慢[15-16]。96 h后，10 mg/L 处理组的鱼游动渐缓，呼吸越发急促，碰触时鱼反应迟钝，经常浮上水面呼吸。15 mg/L 与20 mg/L 处理组出现鱼死亡。96 h 后换水，受试鱼开始几分钟会出现一些烦躁不安的中毒症状，后续平静下来。没发现死亡情况，原因可能是已经适应环境。

染毒96 h后，1,2,4-TCB 与斑马鱼致死率的剂量效应关系曲线如图1 所示。将浓度换成浓度对数，将致死率换成概率单位，得到1,2,4-TCB 概率单位与对数浓度的曲线方程y=4.821 4x-0.449 5，相关系数r=0.852 8，概率P＜0.001，二者呈现良好的线性关系。由概率单位法可得，染毒96 h 后斑马鱼LC50为3.94 mg/L，95%置信区间为3.14～4.74 mg/L。

图1 染毒96 h 后1,2,4-TCB 与斑马鱼致死率的剂量效应关系曲线

2.2 斑马鱼胚胎体外染毒试验

本研究将72 h 时孵化不出来的胚胎作为卵凝结一起统计。与对照组相比，经1,2,4-TCB 处理后的斑马鱼胚胎产生各种毒理学终点，主要有卵凝结、原肠胚向外凸、尾短无延伸、心包囊水肿、孵化延迟或不孵化等。卵凝结导致胚胎停止发育，趋于死亡或者已死亡。当1,2,4-TCB 浓度为0 mg/L时，斑马鱼胚胎未出现致死效应。随着试剂浓度升高，斑马鱼胚胎致死率升高。在同一浓度，随着受试时间的增加，卵凝结的比例增大。由此得知，斑马鱼胚胎体外染毒试验存在一定的时间效应与剂量效应。

2.3 斑马鱼胚胎体内染毒试验

用1,2,4-TCB 处理斑马鱼，不仅对其生长有一定影响，也对其产卵数量及其正常受精有一定影响。1 mg/L 处理组的斑马鱼卵影响不明显，随着浓度的升高，影响逐渐增大，10 mg/L 处理组的斑马鱼未受精卵约占一半。采用不同浓度的1,2,4-TCB 对斑马鱼处理9 d，之后观察其产的鱼卵，试验发现，卵凝结效应明显，且具有较高的致死率，随着浓度的增加，斑马鱼卵凝结增加。对于同一浓度处理过的斑马鱼，随着时间的延长，其卵凝结比例增大。对比可知，1,2,4-TCB 对斑马鱼胚胎体外染毒的毒性效应要比体内染毒明显。

3 结论

本试验采用1,2,4-TCB 对斑马鱼及其鱼卵进行处理。斑马鱼急性毒性试验显示，1,2,4-TCB 对斑马鱼的毒性具有明显的剂量效应，当浓度大于10 mg/L时，中毒症状明显。1,2,4-TCB 能致斑马鱼胚胎卵凝结、尾部延伸少、脊椎弯曲、畸形及致死率上升。1,2,4-TCB 对斑马鱼胚胎发育具有明显的致畸作用，相比体内染毒，体外染毒对斑马鱼胚胎影响更明显，主要表现在致畸方面。1,2,4-TCB 对生态环境具有潜在危害，本试验数据可为其生态风险评估提供依据。