壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合包装对低温和常温贮藏蓝莓保鲜效果的影响

梁晓云，赵王晨，张 晨，王曦琦，王思亓，宓晓雨，王龙凤

（南京师范大学食品与制药工程学院，江苏南京 210023）

蓝莓（Vacciniumspp.）属杜鹃花科越橘属植物，因其丰富的营养成分备受消费者欢迎。 蓝莓果实含有大量维生素、类黄酮、酚酸和花青素等生物活性化合物，有助于预防心血管疾病、癌症、炎症和其他慢性病的发生[1-2]。然而，蓝莓果肉多汁，果皮柔软，在贮藏过程中极易受到机械损伤和微生物侵袭，从而引起炭疽病、灰霉病等一系列生理病害[3]，导致蓝莓品质下降，造成不可挽回的经济损失。因此，开发安全高效的蓝莓保鲜技术成为目前亟待解决的问题。目前，蓝莓的主要保鲜方法有低温贮藏、气调保鲜、辐照处理和涂膜处理和活性包装等。近年来，活性包装因具有良好的可降解性、气体阻隔性、光线防护、抗氧化活性和抗菌活性被广泛研究[4]。

壳聚糖（chitosan）是通过甲壳素脱乙酰化获得的一种天然多糖，因其生物相容性、抗菌活性、抗氧化性和成膜特性成为塑料基包装材料的理想替代品[5]。然而，较差的热稳定性和机械性能限制了壳聚糖在食品包装材料中的广泛应用。近年来，由于纳米技术的飞速发展，基于壳聚糖的活性纳米复合材料为壳聚糖基包装材料的研究开拓了新的方向[6]。纳米材料的引入增加了壳聚糖的机械性能、热稳定性、水蒸气/气体阻隔性能以及活性功能，且不影响其降解特性[7]。Xing等[8]表示壳聚糖纳米TiO2复合涂层可以增强蓝莓营养成分的维持。Sun等[9]将人参渣多糖与壳聚糖共混制成抗菌复合膜，用以延长鲜切甜瓜等的货架期。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是绿茶中的重要生物活性成分，具有良好的抗氧化、抗菌和抗肿瘤功效，有望被广泛应用于食品加工[10]和制备果蔬保鲜活性包装材料。然而，EGCG在高温、中性或弱碱等条件下易发生氧化导致失活，极大降低了它的加工利用率[11]。利用纳米技术将EGCG与其他纳米结构相结合，可有效提高其热稳定性，使之在热环境下保持良好的抗氧化及抗菌活性[12]。纳米黑色素（melanin nanoparticles，MNPs）是一类天然聚合物，存在于各种动植物和微生物体中，研究证实MNPs有突出的自由基清除、金属离子螯合等特性[13]。同时，MNPs能够增强多种生物基（壳聚糖[14]、明胶[15]、卡拉胶[15]、琼脂[16]）包装薄膜材料的性能。最新研究发现，黑色素能够通过ππ堆积和/或氢键相互作用与各种具有芳香结构的活性物质结合，其作为纳米载体被有效的应用于构造活性物质的递送系统[17]。因此，本研究合成黑色素纳米颗粒作为EGCG的纳米载体，获得一种新型纳米复合材料EGCG@MNPs，以提高EGCG的稳定性和利用效率；并将复合纳米粒子掺入壳聚糖基质，通过流延法制备壳聚糖基纳米复合薄膜；通过包装形式，研究其对低温和常温贮藏期间蓝莓果实品质的影响，以期找到一种新的延长蓝莓货架期的保鲜方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试蓝莓 于2021年8月17日采购自江苏省南京市某农产品集散中心，果实于当天采摘后保存于4 ℃环境下运回实验室，挑取大小均匀、成熟度一致、无病虫害和机械损伤的蓝莓果实备用；壳聚糖（脱乙酰度80%～95%）、冰醋酸（纯度≥99.5%）、甘油（纯度≥99%）、磷酸二氢钠（纯度≥99%）、磷酸氢二钠（纯度≥99%）、过硫酸钾（纯度≥99%）、甲醇（纯度≥99%） 国药（上海）集团化学试剂有限公司；没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS） 源叶生物科技有限公司；盐酸多巴胺（纯度≥99%） 阿达玛斯试剂有限公司；LB琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） 北京陆桥科技有限公司。

CR-10 Plus色差仪 柯尼卡美能（中国）有限公司；SYS-GH30A果蔬呼吸测定仪 辽宁塞亚斯科技有限公司；GY-4水果硬度计 北京沃威科级有限公司；Pico-21高速冷冻离心机 德国Thermo Fisher公司；SW-CJ-2F超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；UV759紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；ZHTE-48多样品组织研磨仪 南京卓恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EGCG@MNPs复合纳米粒子的制备 EGCG@MNPs纳米粒子按照实验室之前报道的方法制备[12]。将500 mg盐酸多巴胺溶于50 mL去离子水中，以500 r/min的转速连续搅拌，直至盐酸多巴胺完全溶解，然后滴入1.5 mL 1 mol/L NaOH，并缓慢加入50 mL的1 mg/mL EGCG溶液，在25 ℃下连续搅拌24 h。所得到的纳米悬浊液于15000 r/min下离心15 min，洗涤三次，获得EGCG@MNPs沉淀。将沉淀冷冻干燥48 h，得到EGCG@MNPs纳米粒子，并保存于4 ℃备用。

1.2.2 壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合膜的制备采用流延法制备壳聚糖膜与EGCG@MNPs纳米复合膜。首先，将40 mg EGCG@MNPs超声分散于150 mL 1%乙酸溶液中。将甘油（30 wt%壳聚糖）作为增塑剂加入溶液中，不断搅拌，然后将4 g壳聚糖粉末溶解到溶液中，在90 ℃下持续搅拌30 min。然后将成膜液浇铸在聚四氟乙烯模具（21 cm×30 cm×0.5 cm）上，室温下干燥48 h后将薄膜从模具表面剥离，在25 ℃和50% RH条件下放置至少72 h，以达到稳定状态。所有薄膜样品一式三份。同时，在相同条件下制备不含EGCG@MNPs纳米粒子的纯壳聚糖膜。

1.2.3 蓝莓包装及贮藏流程 使用热封机将裁剪后的壳聚糖薄膜进行热封，制成三面封口的保鲜袋（10 cm×15 cm），其中一口留作蓝莓的填充口，在蓝莓填充完成后进行热封。将蓝莓置于无菌操作台内，随机选取成熟度一致、无损伤虫害的健康蓝莓，将蓝莓称重后分别装入壳聚糖包装和壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合包装，每袋装入60 g左右蓝莓，并准确记录好袋中蓝莓的初始重量，每个包装袋分别做三个平行。包装完成后，将样品放置于有孔PET透明盒中，分别置于25和4 ℃下进行贮藏，未进行膜包装处理的蓝莓作为对照。25 ℃贮藏蓝莓每隔2 d取样测定各项指标，4 ℃贮藏蓝莓每隔4 d取样测定各项指标。并从各处理组随机选取部分蓝莓果实分别用液氮速冻，置于-80 ℃环境中储存用于后续其它生理指标测定。分别将对照组、纯壳聚糖膜组和壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合膜组简称为C、CH和CHEM。

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 失重率 通过贮藏前后的质量差来计算蓝莓果实失重率[18]，失重率计算公式如下。

1.2.4.2 腐烂率 果实出现明显绵软、破损、流汁和霉变的被确定为腐败果。蓝莓的腐烂率由式（2）确定。

1.2.4.3 呼吸强度 使用果蔬呼吸测定仪来测量果实的呼吸强度，将50 g蓝莓果实置于200 mL密封容器中，在同一温度和湿度下进行测量，并保持测量环境气流稳定。以CO2产生量表示蓝莓果实的呼吸强度，单位为CO2mg/kg·h。

1.2.4.4 表观品质和颜色指标 使用高清相机记录各贮藏天数样品的表观品质。使用手持式色差仪测定蓝莓果实的各项颜色指标L*、a*、b*值，其中L*代表亮度、a*代表红绿色调、b*代表蓝黄色调，并计算蓝莓褐变指数[19]，计算见式（3）。

1.2.4.5 硬度 采用手持式果实硬度计测定蓝莓果实的硬度。将蓝莓果实平稳放置于测试台上，硬度计垂直匀速向下刺入蓝莓表皮，并将硬度计调成Autopeak模式，自动记录峰值。随机选取十颗蓝莓果实进行测量并取平均值，单位为N。

1.2.4.6 微生物指标 参考Yang等[20]的方法测定贮藏蓝莓的微生物指标，并稍作修改。将10 g蓝莓果肉置于无菌均质袋中，加入90 mL的0.9%无菌生理盐水，并使用拍打均质机将均质袋正反面拍打均匀。将混合溶液进行梯度稀释（10-1～10-6），吸取100 μL稀释液均匀涂抹在LB琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 平板上，然后分别在 37和28 ℃下培养以观察细菌和真菌的数量。微生物计数的单位表示为lg CFU/g。

1.2.4.7 pH和可溶性固形物（TSS） 将液氮预冻的蓝莓样品放入组织研磨仪，取5 g研磨样品，加入15 mL去离子水，10000 r/min、 4 ℃冷冻离心20 min。使用pH计测量上清液，记录蓝莓果实的pH。采用手持式糖度计测定可溶性固形物含量。将上清夜滴于糖度计棱镜玻璃面上，取3次读数平均值[21]。

1.2.4.8 多酚氧化酶和过氧化物酶活力的测定 多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活力参考邹小波等[19]的方法略作修改。

PPO：准确称取2.5 g研磨样品，加入5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS, pH6.5），10000 r/min、4 ℃冷冻离心20 min，提取上清液。取50 μL上清液，加入1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚溶液和1.95 mL 0.2 mol/L PBS溶液 （pH6.5），摇匀后迅速放于紫外-可见分光光度计内，记录反应体系在420 nm处5 min内吸光度的变化，每20 s记录一次。以每克样品每分钟吸光度变化值增加1为一个活力单位（U）。对照用蒸馏水代替上清液。

POD：取50 μL与PPO相同处理的上清液，加入0.15 mL 10 g/L愈创木酚、 0.15 mL 过氧化氢（体积分数1%）、2.66 mL PBS溶液（pH6.5）。摇匀后迅速放于紫外-可见分光光度计内，记录反应体系在470 nm处5 min内吸光度的变化，每20 s记录一次。以每克样品每分钟吸光度变化值增加1为一个活力单位（U）。对照用蒸馏水代替上清液。

1.2.4.9 蓝莓花色苷含量测定 使用pH差法测定蓝莓果实的花色苷含量[22]。准确称取5 g蓝莓研磨样品，加入10 mL酸化甲醇（0.1% HCl），摇匀后4 ℃避光放置2 h。然后15000 r/min冷冻离心10 min，提取上清液备用。吸取0.2 mL蓝莓上清液分别用醋酸钠缓冲液（pH4.5）或氯化钾缓冲液（pH1.0）稀释，混合摇匀后于28 ℃放置5 min，使用紫外-可见分光光度计分别于500和700 nm处测定吸光度，对照用蒸馏水代替蓝莓上清液。将花色苷含量表示为每100 g样品矢车菊素-3-葡萄糖苷当量（mg/100 g），计算见公式（4）。

式中：A =(A500-A700)pH1.0-(A500-A700)pH4.5；MW表示矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2）；DF表示稀释倍数；V表示样液体积，mL；m表示样品质量，g；ε=26900 L/（mol·cm）；d表示比色皿厚度，1 cm。

1.2.4.10 蓝莓抗氧化活性的测定 使用DPPH自由基清除法[23]测量蓝莓提取物的总抗氧化活性。吸取1.2.4.9节上清液0.2 mL与3 mL DPPH甲醇溶液混合摇匀，在室温避光条件下放置30 min。对照用0.2 mL甲醇溶液代替上清液。在517 nm处测定混合液的吸光度，并按照式（5）计算提取液的DPPH自由基清除率。

式中：A0表示对照样品的吸光度；A1表示所测样品的吸光度。

1.3 数据处理

最终数据均以平均值±标准差表示。使用Excel 2019进行数据记录处理，用SPSS 16.0进行方差分析和差异显著性分析，P＜0.05表示差异性显著。用Origin 8对数据进行拟合并作图。

2 结果与分析

2.1 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓失重率和腐烂率的影响

失重率是反映蓝莓贮藏品质的重要指标之一。由于蓝莓采后的呼吸作用和蒸腾作用，导致蓝莓的养分消耗和水分流失，从而造成蓝莓的质量损失[24]。失重的主要表现是果实皱缩和变质，由图1A和图1B可知，随着贮藏时间的增加，各处理组蓝莓样品的失重率不断增加。4 ℃贮藏蓝莓比25 ℃贮藏蓝莓有更低的失重率，且上升幅度更平缓，主要因为蓝莓在低温环境中减缓了呼吸作用和蒸腾作用，从而减少水分流失。除此之外，CH-EM组在贮藏期间的失重率显著低于C和CH组（P＜0.05）。在贮藏结束时，4和25 ℃经纳米复合包装处理的贮藏蓝莓的失重率分别比对照组低0.9%和8.1%。本实验结果与Eldib等[25]的结果类似，他们将含有壳聚糖薄膜涂层的纳米材料分别与乳链菌肽和二氧化硅粒子结合，涂层处理有效地控制了蓝莓的失重率，可以有效保持新鲜蓝莓的质量。由此说明，纳米复合包装能够为蓝莓提供良好的屏障，可以作为果实贮藏过程中水分损失的保护层，这是因为具有微孔结构的纳米复合薄膜用于蓝莓包装，可以减少氧气和二氧化碳等气体交换，同时防止水分子从果实表面快速流失，并一定程度上减缓了呼吸作用，使体内有机物质消耗减少，有效减轻了蓝莓在贮藏过程中的重量损失。蓝莓的果实腐烂通常是由于机械损伤和真菌引起的。由图1C和图1D可知，各温度贮藏蓝莓的腐烂率变化表现了和失重率相同的趋势。各处理组蓝莓的腐烂率随着贮藏时间的增加而增加，且4 ℃贮藏蓝莓在各阶段的腐烂率均低于25 ℃贮藏蓝莓。经包装处理的蓝莓比对照组有着更低的腐烂率（P＜0.05），在4 ℃环境下贮藏12 d后，CH组和CHEM组的失重率比对照组分别低4.8%和8.4%，且在贮藏后期，CH-EM组的失重率几乎趋于平缓，而常温贮藏蓝莓则仍然有上升趋势。包装组的腐烂率较低是由于薄膜自身出色的吸湿性能，它能及时吸收蓝莓贮藏过程中产生的水蒸气，使包装内保持干燥，防止腐败菌生长[24]。除此之外，壳聚糖和EGCG@MNPs出色的抗菌性能也有效抑制了环境中有害微生物的生长[12]，从而控制了蓝莓果实的腐败。

图1 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓失重率和腐烂率的影响Fig.1 Effects of nanocomposite packaging on weight loss and decay rate of blueberries during storage

2.2 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓呼吸强度和硬度的影响

蓝莓属于呼吸越变型水果，在采后仍然能进行呼吸作用，呼吸强度能够反映出蓝莓果实的衰老程度[26]。由图2A所示，4 ℃环境下的各处理组蓝莓呈现先上升后下降的趋势，从第4 d开始，CH组和CH-EM组的呼吸强度变化趋于平稳，而C组蓝莓则在第8 d时出现呼吸高峰，且包装处理的蓝莓呼吸强度显著低于对照组（P＜0.05），在贮藏结束时，CH组和CH-EM组的呼吸强度分别比对照组低15.7%和27.0%。说明纳米复合包装处理能够有效抑制蓝莓的呼吸强度，且延缓了果实呼吸高峰的出现。而25 ℃贮藏蓝莓的CH组和CH-EM组则表现了与对照组相同的变化趋势（图2B），同样，包装组蓝莓果实有着更低的呼吸强度。在第6 d时，由于常温贮藏蓝莓的高腐败率，导致蓝莓呼吸强度呈上升趋势。吕静祎等[26]发现将壳聚糖-山竹果皮提取液复合涂膜处理蓝莓后，蓝莓的呼吸强度被有效地抑制，本实验也得到了类似的实验结果。由此可知，低温结合纳米复合包装是蓝莓果实一种有效的保鲜方法。

作为质地较柔软的水果，硬度是蓝莓果实最重要的质量指标之一，它直接影响到果实的品质以及商业价值。蓝莓硬度下降主要是由于水分流失、果实腐败、细胞壁崩解、膨压和膜损伤所引起。其中，细胞壁和中层多糖（果胶、半纤维素和纤维素）代谢被认为是导致蓝莓果实软化的首要因素[27]。由图2C和图2D可知，随着贮藏天数的增加，各蓝莓处理组的硬度呈整体下降趋势。相较于常温贮藏蓝莓，冷藏贮藏蓝莓的下降趋势更趋于平缓，且在贮藏结束时，4 ℃贮藏蓝莓各组硬度均能保持在2.4 N以上，而25 ℃贮藏蓝莓则在第6 d时各组蓝莓硬度就均处于2.4 N以下。除此之外，复合纳米包装处理也延缓了蓝莓果实硬度的下降。由于EGCG@MNPs纳米粒子的加入，提高了壳聚糖-EGCG@MNPs薄膜的水蒸气阻隔性能，所以在贮藏期间，纳米复合包装有效阻止了蓝莓水分流失和环境中微生物的繁殖，同时降低了蓝莓的代谢活性，这是维持蓝莓果实饱满度和硬度的关键。这与汪东风等[28]通过壳聚糖复合膜处理蓝莓的结果一致。

图2 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓呼吸强度和硬度的影响Fig.2 Effects of nanocomposite packaging on respiration rate and hardness of blueberries during storage

2.3 纳米复合包装对蓝莓贮藏期间微生物生长的影响

蓝莓采后会受到一些细菌如鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的侵染，蓝莓果实受真菌如灰霉病菌、链格孢菌和炭疽菌等感染后还会引起灰霉病、果实腐烂病和炭疽病等病害[3]。图3A和图3B分别显示了蓝莓在冷藏和常温贮藏环境下细菌的生长情况，所有处理组均呈现了上升的趋势。在冷藏蓝莓贮藏初期，各组细菌菌落总数差异较小，在贮藏4 d后包装处理蓝莓的细菌菌落总数显著低于对照组（P＜0.05），且菌落总数增加缓慢，在第12 d，对照组的细菌菌落总数为5.01 lg CFU/g，而CH组和CH-EM组分别为3.92和3.58 lg CFU/g。与冷藏蓝莓相比，常温贮藏蓝莓CH组和CH-EM组在贮藏后期仍有较大幅度的上升趋势，但CH-EM组的细菌菌落总数要显著低于其他组（P＜0.05）。图3C和图3D分别显示了蓝莓在冷藏和常温贮藏环境下真菌的生长情况，所有样品的真菌菌落总数均呈现了先下降后上升的趋势，同样的，常温贮藏4 d后的真菌菌落总数的上升幅度显著高于冷藏蓝莓（P＜0.05）。在贮藏结束时，CH-EM组在冷藏和常温下的真菌菌落总数分别比对照组低27.9%和18.7%。

图3 纳米复合包装对蓝莓贮藏期间微生物生长的影响Fig.3 Effects of nanocomposite packaging on microbial growth of blueberries during storage

实验结果表明，壳聚糖包装和纳米复合包装能显著抑制蓝莓在贮藏期间的微生物生长，延缓了蓝莓的腐败，有效延长了食品的保质期。这归因于壳聚糖和EGCG@MNPs出色的抗菌性能。曹森等[29]采用丁香提取液结合壳聚糖处理能够显著抑制蓝莓采后真菌菌落总数上升，降低了果实的腐烂率。在实验室之前的研究中，已经证明了EGCG@MNPs具有优越的抗菌性能，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别仅为0.8和0.2 mg/mL[12]。EGCG@MNPs纳米粒子的加入有效提高了壳聚糖薄膜的抗菌活性。综上所述，壳聚糖/ EGCG@MNPs纳米复合膜是蓝莓的一种有效抗菌保鲜包装材料。

2.4 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓颜色的影响

颜色是蓝莓果实新鲜度最重要的指标之一，颜色的变化直接反应出蓝莓果实的品质以及商业价值[30]。L*值主要体现蓝莓果实的亮度，L*值越大表示果实越有光泽。由图4A和图4B可知，贮藏期间蓝莓果实的亮度呈下降的趋势，冷藏蓝莓亮度的下降趋势相较于常温蓝莓较为平缓，且贮藏期间CH-EM组蓝莓L*值始终高于其余组。a*值代表了果实的红绿程度，a*值越大表示果实色泽越红，反之则色泽越绿。如图4C和图4D所示，在4 ℃ 环境下CHEM组的a*值在贮藏期间维持着较稳定的状态，对照组和CH组则有着不同幅度的变化，但总体来说变化不大，贮藏结束时对照组和CH组a*值相较于贮藏前分别提高了0.35和0.05。常温贮藏蓝莓的a*值则呈现总体上升的趋势，在贮藏期间，对照组的a*值显著高于处理组（P＜0.05），而包装组之间则没有显著性差异（P＞0.05），且上升幅度平缓。b*值表示了果实的黄蓝度，b*值越表示果实色泽越黄，反之则色泽越蓝。如图4E和图4F所示，各样品组的b*值均有不同程度的提升。冷藏蓝莓的CH组在贮藏前期的b*值提升较大，但在贮藏后期，CH组和CH-EM组的b*值均显著低于对照组（P＜0.05）。而常温贮藏蓝莓b*值上升幅度较大，贮藏结束时，C组、CH组和CH-EM组的b*值相较于贮藏分别提高了5.02、3.12和2.05。

图4 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓颜色的影响Fig.4 Effects of nanocomposite packaging on the color of blueberries during storage

褐变指数综合体现了果实色泽变化。如图4G和图4H所示，各样品组的褐变指数总体上均表现出了上升的趋势。在贮藏前期，冷藏蓝莓的CH组褐变指数上升速度显著高于对照组和CH-EM组（P＜0.05），这可能是由于纯壳聚糖薄膜较高的水蒸气透过率加速了包装环境中氧气与水蒸气的交换[31]，这促进了蓝莓的氧化褐变，从而导致CH组包装蓝莓的褐变指数在前期高于对照组，但在贮藏后期CH和CH-EM组则均趋于平缓，而对照组仍有上升趋势。在常温贮藏期间，纳米复合包装蓝莓的褐变指数上升速度则显著低于对照组和壳聚糖包装组（P＜0.05）。综上所述，CH组和CH-EM组能够有效地保持蓝莓的颜色特性。这可能是由于包装阻止了蓝莓果实与空气的接触，从而减少了褐变[19]。此外，蓝莓中的花青素作为一种色素可以携带壳聚糖作为一种正电荷来帮助维持蓝莓的颜色[32]。

2.5 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓pH和TSS的影响

图5A和图5B展示了蓝莓在贮藏期间pH的变化，所有蓝莓样品的pH均呈现了上升的趋势。在冷藏条件下，蓝莓的pH上升缓慢，且包装组之间无显著性差异（P＞0.05）。在常温贮藏前期，对照组pH的上升速度则显著高于包装组（P＜0.05），贮藏结束时，对照组、CH组和CH-EM组的pH由贮藏前的3.23分别上升到了3.64、3.52和3.41。蓝莓果实在贮藏期间pH的上升可能是由于采后代谢反应的继续发生，导致果实中的酸被转化为其他物质[33]。

图5 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓pH和TSS的影响Fig.5 Effects of nanocomposite packaging on pH and TSS of blueberries during storage

可溶性固形物是反映果实的成熟程度和品质的重要指标之一，TSS值越高，则果实口感越好[34]。如图5C和图5D所示，随着贮藏时间的增加，两种贮藏温度下的贮藏蓝莓的TSS值均呈下降的趋势。如图所示，CH-EM组的TSS含量下降速度显著慢于对照组和CH组（P＜0.05）。在贮藏结束时，冷藏CHEM组的TSS含量分别是对照组和CH组的1.17和1.05倍，常温CH-EM组的TSS含量则分别是对照组和CH组的1.09和1.05倍。蓝莓贮藏过程中TSS含量的变化可能是由于呼吸消耗或者大分子碳水化合物部分水解为TSS引起的，低温条件可以抑制蓝莓的呼吸作用，还可以减少水分的流失[8]，可见低温条件能够更好的维持蓝莓的TSS含量。CHEM组蓝莓能够保持较高TSS含量的原因可能是包装薄膜对气体的选择性通过抑制了蓝莓采后的呼吸强度，从而减少了呼吸底物的消耗[26]。此外，由于后期微生物对蓝莓果实的侵蚀增加，也会导致TSS含量的下降[35]。

2.6 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓PPO和POD活性的影响

PPO是广泛存在于植物体中的一种氧化酶，其活性与果蔬的褐变有着密切的关系，是果蔬品质的重要指标之一[34]。如图6A和图6B所示，各处理组在贮藏前期呈现下降趋势，在贮藏后期则呈现缓慢上升的趋势，而对照组则呈现了波动性的变化趋势，在贮藏结束时，常温对照组PPO活性最高可达45.33 U·min-1·g-1，同时诱导酚类化合物的积累。在贮藏期间，CH-EM组蓝莓PPO活性显著低于其他组（P＜0.05），且在冷藏环境下表现了更低的PPO活性，冷藏结束时CH-EM组蓝莓PPO活性低至16 U·min-1·g-1。这说明低温配合纳米复合包装能够更有效的抑制PPO活性的增加。2.4中褐变指数的结果也验证了这一结论，贮藏期间蓝莓PPO的活性变化与邹小波等[19]研究的研究成果一致。

POD是存在于植物体中的一种重要的活性酶，其能够与过氧化氢酶产生协同作用，将植物体中的H2O2分解成H2O和O2，从而减少活性氧自由基对细胞的伤害，其活性也与蓝莓果实的成熟度有着密切的关系[36]。图6C和图6D显示了贮藏期间蓝莓果实POD活性的变化，冷藏蓝莓的POD活性呈现了先上升后下降的趋势，而常温蓝莓则是展现了总体下降的趋势。在贮藏后期，相较于其他组，CH-EM组的蓝莓均表现了较高的POD活性。贮藏期结束时，冷藏蓝莓对照组、CH组以及CH-EM组的POD活性分别比常温组高了10.1、21.6和28.38 U·min-1·g-1。说明低温环境更有利于维持蓝莓的POD活性。贮藏后期蓝莓POD活性的下降，主要是由于蓝莓果实的衰老产生了过量的自由基抑制了POD的活性[37]。壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合包装则延缓了果实的衰老，为提供了良好的抗氧化环境，且薄膜隔绝了部分氧气，抑制了蓝莓的氧化行为，有效维持了蓝莓POD的活性。也有研究表明，随着贮藏天数的逐渐增加，蓝莓活性氧代谢失调导致H2O2积累，从而诱导了POD活性升高[18]。

图6 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓PPO和POD活性的影响Fig.6 Effects of nano-composite packaging on PPO and POD activities of blueberries during storage

2.7 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓花色苷含量的影响

花色苷是存在于蓝莓果皮中的的一种天然水溶性植物色素，其具有抗氧化、抗炎、改善视力和预防心血管疾病等多种生理活性功能，其含量是蓝莓品质重要的参考指标之一[38]。由图7A和图7B所示，在贮藏期间，蓝莓花色苷含量呈现了先轻微上升后缓慢下降的趋势。随着贮藏时间的增加，包装处理蓝莓的花色苷含量的下降速度显著低于对照组（P＜0.05）。在4 ℃贮藏12 d后，包装组蓝莓之间无显著差异（P＞0.05），而常温贮藏蓝莓在第6 d后，CH-EM组蓝莓花色苷含量则显著高于其他组（P＜0.05）。在贮藏结束时，4和25 ℃环境下经过纳米复合包装处理的蓝莓花色苷含量分别保留了90.1%和99.0%，而对照组分别只有79%和86%。蓝莓花色苷含量的下降主要是因为贮藏期间自由基的产生，使得花色苷作为抗氧化剂被消耗。而壳聚糖和EGCG@MNPs提供了优良的抗氧化效果，延缓了花色苷的消耗，使蓝莓果实能够保持较高的花色苷含量水平。沈春华等[21]探讨不同活性抗菌薄膜对蓝莓低温贮藏品质的影响，结果表明含有精油的活性抗菌薄膜能延缓果实花色苷和VC含量的降低，与本研究花色苷含量变化趋势相似。

图7 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓花色苷含量的影响Fig.7 Effects of nanocomposite packaging on anthocyanin content in blueberries during storage

2.8 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓抗氧化活性的影响

蓝莓的抗氧化活性是蓝莓品质最重要的参考指标之一，蓝莓果实中含有丰富的抗坏血酸、花青素、酚类物质等内源性抗氧化剂，其抗氧化能力能够反映蓝莓果实自身对自由基的清除能力[2]。如图8A和图8B所示，各组蓝莓对DPPH自由基的清除活性呈现了与花色苷含量类似的变化趋势，在贮藏前期蓝莓的DPPH自由基清除活性轻微上升，后期则呈现缓慢下降的趋势，且纳米复合包装处理的蓝莓一直维持着较高的自由基清除水平。在贮藏结束时，4和25 ℃贮藏蓝莓CH-EM组的DPPH自由基清除活性分别

比对照组高6.2%和6.3%，而包装组之间则无显著性差异（P＞0.05）。由此说明，包装处理降低了蓝莓的衰老速度，从而有效延缓了蓝莓果实内抗氧化活性物质的分解，使得蓝莓保持了较高的营养水平和抗氧化能力。从吕静祎等[26]的研究中观察到了类似的蓝莓DPPH自由基清除能力的变化趋势。

2.9 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓表观品质的影响

水果的外观是消费者判断其质量的主要因素，蓝莓的表观变化能够在一定程度上直观地反映出蓝莓品质的变化。图9分别罗列了两种贮藏条件下，各样品组蓝莓表观品质的变化。随着贮藏天数的增加，与对照组相比，包装组蓝莓果实的霉变、皱缩和软化现象明显改善。在贮藏结束时，纳米复合包装蓝莓仍然保持着较好的饱满度以及色泽。说明壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合包装是维持蓝莓品质的一种有效保鲜方式。

图9 纳米复合包装对贮藏期间蓝莓表观品质的影响Fig.9 Effect of nanocomposite packaging on apparent quality of blueberries during storage

3 结论

本研究以壳聚糖为包装薄膜基质，添加EGCG@MNPs纳米粒子作为活性填料制备成壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合薄膜，并以包装形式探讨纳米复合薄膜对低温和常温贮藏蓝莓品质的影响。结果表明，壳聚糖包装减少了蓝莓的腐烂率和失重率，延缓了硬度、POD活性以及花色苷含量的下降，并有效维持了蓝莓果实的颜色水平和抗氧化能力。EGCG@MNPs纳米粒子的加入为包装环境提供了更优越的抗菌和抗氧化水平，减少了微生物对蓝莓果实的侵袭，同时有效地降低了体内自由基的积累速率，减少了活性物质的消耗，在蓝莓贮藏后期维持了较高的POD活性和花色苷含量。而且薄膜对气体的阻隔作用显著抑制了蓝莓果实采后的呼吸作用，减少了因呼吸导致的营养物质消耗和水分散失，同时也延缓了果实褐变的发生。纳米复合包装在抑制蓝莓呼吸强度、果实褐变、改善生理代谢以及维持果实表观品质方面表现出了更优秀的水平。与此同时，相较于常温贮藏环境，冷藏环境更有利于保持蓝莓果实的贮藏品质，延长采后蓝莓的保质期。

综上分析，壳聚糖/EGCG@MNPs纳米复合装结合低温是维持采后蓝莓品质的最佳贮藏方式，并在果蔬保鲜方面具有广阔的应用前景。