产甲壳素脱乙酰酶赖氨酸芽孢杆菌的筛选及产酶初探

孟 欣，艾国峰，姜国涛，谢克毅，姜爱莉

（烟台大学生命科学学院，山东烟台 264005）

甲壳素（C8H13O5N）n，又称甲壳质，由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键缩合而成，广泛存在于甲壳动物、软体动物的骨骼、昆虫外壳及真菌的细胞壁中[1-2]。天然甲壳素的溶解性能较差，导致其应用受到极大限制。壳聚糖（chitosan）作为甲壳素脱除N-乙酰基后的产物[3-4]，其溶解性得到极大改善，广泛应用于医药卫生[5]、食品工业[6]、轻纺工业[7]和农业[8]。

目前工业及研究中利用甲壳素生产壳聚糖的方法主要采用强酸强碱，不仅消耗大量试剂，而且对环境造成严重污染，增加了后续污染物的处理成本。而利用生物法酶解甲壳素获得壳聚糖，得到较高品质壳聚糖产物的同时，避免了强酸强碱的使用，实现了环境友好的目标。甲壳素脱乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）（E.C.3.5.1.41），专一脱除甲壳素中N-乙酰基[9-10]，将甲壳素转化为壳聚糖。目前，利用生物酶法制备壳聚糖已经成为甲壳素工业应用最具发展前景的技术之一[11]。现阶段的甲壳素脱乙酰酶微生物来源较窄，真菌以鲁氏毛霉[12]、构巢曲霉[13]、蓝色犁头霉[14]等为主，细菌主要包括芽孢杆菌[15-16]、弧菌[17]等。目前甲壳素脱乙酰酶价格较为昂贵[10-18]，而且产量有限，难以进行工业化应用，因此，筛选产CDA性能优良的新菌种仍是解决CDA工业化应用的重要课题之一[19]。

本研究前期发现一瓶自然发酵的虾皮具有较高的固体溶解率，从中选择筛选能够降解天然甲壳素的菌株，以产酶活力和甲壳素脱乙酰度为指标进行复筛，鉴定产酶能力较强的菌株，为工业化生产甲壳素脱乙酰酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试菌种 将虾皮洗净后干燥，埋于校园杨树根部土壤，用于自然富集产甲壳素脱乙酰酶的微生物，数月后取出土样；甲壳素 上海麦克林生物化工有限公司；对硝基-N-乙酰苯胺 生物试剂，上海源叶生物有限公司；NaCl、K2HPO4、MgSO4等试剂 均为分析纯。

D-1 型自动控制压力蒸汽灭菌锅 北京发恩科贸有限公司；BCM-1000A 超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；DHZB-500 细菌振荡培养箱 江苏科析仪器有限公司；MQD-B3R 三层组合式摇床培养箱 上海旻泉仪器有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅

常州国华电器有限公司；SCIENTZ-IID 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司；ZD-2 自动电位滴定仪 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验培养基

初筛培养基：甲壳素2.0 g，对硝基-N-乙酰苯胺

1.0 g，NaCl 0.05 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，Fe2(SO4)30.001 g，琼脂 2.0 g，去离子水 100 mL，pH7.2。

富集培养基：甲壳素 2.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaCl 0.05 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，Fe2(SO4)30.001 g，琼脂 2.0 g，去离子水 100 mL，pH7.2。

斜面培养基：蔗糖 1.0 g，蛋白胨 1.0 g，NaCl 0.05 g，MgSO40.01 g，琼脂 2.0 g，去离子水 100 mL。

复筛培养基：甲壳素2.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.05 g，K2HPO40.05 g，MgSO40.05 g，Fe2(SO4)30.001 g，去离子水 100 mL，pH7.3。

种子培养基：蔗糖1.0 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.05 g，MgSO40.01 g，去离子水100 mL。

发酵培养基：甲壳素3.0 g，(NH4)2SO40.3 g，

NaCl 0.05 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.02 g，NaHPO40.6 g，去离子水100 mL，pH7.0。

1.3 实验方法

1.3.1 初筛培养 采用平板涂布法[20]。称取10 g自然发酵的虾皮，放入装有90 mL无菌水（含玻璃珠）的锥形瓶中，充分振荡后用无菌水按梯度稀释，分别吸取10-3、10-4、10-5梯度的稀释液200 μL，涂布于初筛培养基，置于30 ℃培养箱中培养3～4 d。产CDA的菌株周围会出现黄色，根据显色圈的深浅判断产酶能力的高低。挑取菌落周围显黄色的菌株，于富集培养基进一步划线分离纯化至得到单一菌落，转接至斜面培养基中保存。

1.3.2 复筛培养 初筛培养基中筛选出来的菌株进行摇瓶复筛[20]，300 mL锥形瓶中装入复筛发酵培养基100 mL，30 ℃，180 r/min培养5 d。发酵液在室温条件下于8000 r/min离心15 min，所得上清液即为胞外 CDA酶粗酶液；离心后剩余的底部湿润固体平均分为两部分，一部分用无菌水洗涤数次后进行冷冻干燥，干燥后加入冷Tris-HCl缓冲液进行细胞破碎，8000 r/min离心10 min，上清液为胞内CDA粗酶液[21]；另一部分用于测定脱乙酰度（degree of deacetylation，DD）。每个菌株做3组平行。根据酶活力和DD的高低，筛选出降解甲壳素能力较高的菌株。

1.3.2.1 CDA酶活测定 比色管中加入0.05 mol/L、50 ℃ 预保温的磷酸盐缓冲液3 mL，200 mg/L对硝基-N-乙酰苯胺1 mL，粗酶液1 mL，50 ℃ 水浴反应15 min后沸水浴终止反应，用去离子水定容至10 mL，8000 r/min离心10 min，于400 nm处测定上清液的OD值。以相同浓度高温灭活的粗酶液为空白[21]。酶活按照公式（1）计算，上述反应条件下每小时产生1 μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。

式中：A400：酶解液样品的吸光值；A0：空白的吸光值；T：酶促反应时间，h；k：线性系数（0.0648）。

1.3.2.2 脱乙酰度（DD）的测定 发酵液离心后的底部湿润固体，40 ℃烘干，准确称量2.0 g干燥固体，加入过量的HCl溶解，用0.5 mol/L的NaOH溶液滴定，每0.25 mL记录一次pH，在pH突跃点附近缩小间隔改以滴加0.1 mL记录一次[22]。作pH-V电位滴定曲线，找出两个突跃点，按公式（2）计算脱乙酰度：

式中：ΔV：两个“突跃点”之间消耗的氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；c1：氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；10-3：单位换算系数；16：氨基的摩尔质量，g/mol；m1：试样质量，g。

1.3.3 菌种鉴定

1.3.3.1 形态学观察 菌落形态和菌体染色制片参考《常用细菌系统鉴定手册》[23]和《微生物学分类》[24]，显微镜下观察菌株X4的形态特征并对其进行初步鉴定。

1.3.3.2 菌株X4分子鉴定 菌株X4由烟台鑫晟诺生物工程有限公司进行16S rRNA测序。序列在NCBI数据库进行BLAST比对，分析该菌株与其他菌株的同源性，并结合菌株的形态学特征，对菌株X4进行分类鉴定。

1.3.4 菌株X4种子生长曲线 从X4菌株斜面上挑取2环菌苔接入种子培养基，于30 ℃、180 r/min的摇床中培养，每隔1 h测定600 nm处菌液的OD值，以培养时间为横坐标，OD600nm为纵坐标绘制生长曲线。

1.3.5 菌株X4发酵生长曲线和产酶曲线 接种对数生长期的种子液至发酵培养基，于30 ℃、180 r/min的摇床中培养，每隔24 h取样，采用显微镜直接计数法测定发酵液中菌株X4的生物量，以不同培养时间X4生物量为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制生长曲线。同时测定甲壳素脱乙酰酶酶活并绘制出菌株X4产酶曲线。

1.4 数据处理

每个实验组设置三个平行，实验结果用平均值±标准差（n=3）表示，采用SPSS软件对实验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛

微生物产生的CDA可脱除对硝基-N-乙酰苯胺（无色）的N-乙酰基，使之转化为黄色的对硝基苯胺[25]，该特性可用于产CDA菌株的筛选。通过含有对硝基-N-乙酰苯胺的平板筛选得到6株可以使平板变色的菌株，平板初筛及显色情况见图1和表1。其中菌株X4的平板培养基显色最为明显，说明该菌株产脱乙酰酶的能力最强。

表1 菌株平板培养基显色情况Table 1 Color of strains in plate culture medium

图1 菌株初筛平板培养基Fig.1 Initial screening plate of strains

2.2 摇瓶复筛

2.2.1 六株菌的CDA酶活 将6株菌分别接种至发酵培养基培养5 d，测定粗酶液中的CDA酶活

（图2）。结果表明，6株菌的胞内酶活显著高于胞外酶活（P＜0.05），说明菌株主要是以产胞内CDA为主。菌株X4、X5产胞内酶能力较好，菌株X4与其他菌株相比产胞内酶活最为突出（P＜0.05），培养5 d后酶活可达到8.210 U/mL，说明菌株X4具有较强的开发潜力。

图2 六株菌的胞内酶、胞外酶活力Fig.2 Extracellular and intracellular enzyme activities of six strains

2.2.2 菌株对甲壳素的脱乙酰度 将6株菌分别接种至发酵培养基培养5 d，测定甲壳素脱乙酰度（图3）。结果表明，六株菌均具有脱除甲壳素脱乙酰基的能力，不同菌株对甲壳素的脱乙酰度具有显著性差异（P＜0.05），6株菌甲壳素的脱乙酰度分别为7.289%、8.865%、8.872%、8.642%、10.646%和7.545%，菌株X5对甲壳素的脱乙酰度显著高于其他五株菌（P＜0.05）。综合CDA酶活测定结果，选定菌株X4进行16S rRNA序列分析和生化鉴定，并进一步研究其产酶情况。

图3 六株菌的甲壳素脱乙酰度Fig.3 Chitin deacetylation degree of six strains

2.3 菌株X4的菌种鉴定

2.3.1 菌株X4形态学观察 菌株X4在富集培养基上生长迅速，菌落呈土黄色，背面呈褐黄色，菌落表面湿润（图4a）。通过革兰氏染色对其镜检（图4b）发现，该菌为革兰氏阳性菌，结构呈短杆状。

图4 菌株X4的形态学特征Fig.4 Morphological characteristics of strain X4

2.3.2 菌株X4分子鉴定 对菌株X4进行16S rRNA测序，将测序所得基因序列在NCBI上通过BLAST比对后，初步鉴定得出X4为赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillussp.）。采用MEGA-X软件构建系统发育树（图5），菌株X4与Lysinibacillus louembei在同一分支，表明二者亲缘关系最近，进一步证明菌株X4为赖氨酸芽孢杆菌。

图5 基于菌株X4 16S rRNA序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of strain X4

2.4 菌株X4种子生长曲线

由图6可知，菌株X4在培养前期，随着培养时间的延长，种子液中的菌体密度逐步提高，培养至15 h，种子液中的菌体密度达到峰值，随后随着培养时间的进一步延长，种子液中的菌体密度趋于稳定并略有下降趋势。生长曲线表明菌株X4接种5 h后进入对数生长期，11 h到19 h菌株处于稳定期，从20 h后开始进入衰亡期。根据菌株X4的生长曲线，发酵产酶生产时，以培养8 h的培养液作为种子液最佳。

图6 菌株X4生长曲线Fig.6 Growth curve of strain X4

2.5 菌株X4发酵生长及产酶曲线

微生物的生长极易受到外界环境的影响，由图7可知，将菌株X4接种于以（NH4）2SO4为氮源的发酵培养基中时，其生长速度慢于以蛋白胨为氮源的种子培养基，但随着培养时间的延长，菌株X4的菌体密度逐步提高，可以迅速利用发酵底物进行产酶。菌株产酶呈现稳步增长的趋势，培养至120 h时，其胞内和胞外酶活分别达到1.564、 1.461 U/mL。与复筛时相比，酶活明显下降，并且随着培养时间的延长，胞外酶活呈现出下降趋势，可能是因为产酶发酵培养基营养成分的变化、菌体的生长进入了平稳期且开始出现衰亡、酶产物的累积和发酵体系pH发生[26]改变导致。

图7 菌株X4生长和产酶曲线Fig.7 Time course of growth and enzyme formation of strain X4

3 讨论与结论

国内外关于产CDA酶菌株的报道较多，大部分为真菌。菌株产酶能力及CDA酶的活力是其工业应用的重要前提，以产CDA的菌株为对象进行的产酶发酵技术也是目前CDA研究的热点领域[27-28]。但是，目前大多数研究仍以胶体甲壳素作为发酵底物，针对天然甲壳素的研究相对较少。

本研究以天然甲壳素为发酵底物，对菌株X4进行发酵产酶研究，发现产CDA酶活不高，后期可以考虑从以下几方面对菌株进行驯化处理，并优化其发酵条件：其一，进行紫外诱变[28]，获得高产菌株。陈虹等[29]利用紫外线作为诱变剂处理霉菌，经诱变后的菌株产CDA的酶活力达到了88.2%；秦汪艳[30]以丝状真菌Penicillium janthinellumUV-0S为出发菌株，紫外诱变处理其孢子液，结果表明诱变后菌株的CDA酶活是诱变前的2.13倍。其二，对菌株进行基因工程改造[18]，如利用大肠杆菌作为载体，将该菌株的产酶方式由胞内转化为胞外。其三，利用诱导的方式，通过添加产酶诱导物[31-33]，提高CDA产量并缩短发酵周期。

本文以天然甲壳素作为唯一碳源，从自然发酵的虾皮中筛选得到1株具备高产CDA潜力的菌株X4，通过形态学观察和16S rRNA序列分析，初步确定其为赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillussp.）。对该菌株进行发酵培养，其胞内CDA酶活达到8.210 U/mL，对发酵底物甲壳素的脱乙酰度为8.641%。将该菌株培养8 h的种子液接种于发酵培养基，培养至120 h后胞内酶活为1.564 U/mL，胞外酶活为1.461 U/mL。由于天然甲壳素难以被CDA利用和酶本身的复杂性，本实验分离得到的菌株所产CDA的作用机制和特征还有待进一步的研究。