Fuchs 角膜内皮营养不良tcf4 基因变异检测国家参考品的研制

高飞，胡泽斌，贾峥，董喆，黄杰

Fuchs 角膜内皮营养不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，FECD）属于角膜内皮失代偿的显性遗传性角膜疾病，临床表现为进行性失明合并青光眼。该病主要致病基因为tcf4 基因[1]，该基因位于常染色体 18q21.1，全长413 772 bp，包含 34 个外显子，tcf4 基因上的 CTG 重复位于其三号内含子中。tcf4 基因在发育中的角膜内皮和中枢神经系统中表达，并与许多转录调节因子相互作用，例如调节转化生长因子 β 信号转导、上皮向间质转化和细胞凋亡。该病在亚洲人群的发病率约为 3.8%[2]，含有 CTG 重复扩增的患者表型更严重，这一扩增将使视力显著减退的风险增加 30 倍以上。角膜移植是目前挽救患者视力的唯一方法，与没有 CTG 重复扩增的 Fuchs 角膜内皮营养不良患者相比，含有 CTG 重复扩增的患者是急需角膜移植的主要群体。目前唯一有效确定 CTG 重复扩增患者的方法就是进行tcf4基因检测。国家参考品的研制可对国内 FECD 检测试剂盒进行方法学评价以确保其各项性能指标可靠、确保临床检测结果可靠，为临床诊断提供有力证据。

1 材料与方法

1.1 材料

核酸提取用试剂盒采用宝生物工程（大连）有限公司的产品；Fuchs 角膜内皮营养不良参考品的研制所需的细胞系包含的基因型别：扩增型（CTG 重复 38～52）、风险型（CTG 重复 ＞ 52）及 4 个野生型（正常人的样本）均购自中南大学医学遗传学重点实验室；2 个非人源的阴性参考品所需原料为采集非人源病原体感染的细胞，参考品验证实验所采用的试剂盒购自厦门百欧迅生物科技有限公司、深圳泰乐德医疗有限公司、北京阅微基因技术股份有限公司和广州市达瑞生物技术股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料制备 采集足量的临床新鲜血液样本并使用含有枸橼酸钠的一次性抗凝采血管进行保存，低温运输至实验室。在灭菌的环境中，提取临床血液样本的单核淋巴细胞，加入 EB 病毒转化为永生化细胞系并培养及冻存。用核酸提取试剂盒分别对各型别的永生化细胞系进行 DNA 提取，荧光定量仪测定 DNA 浓度、紫外分光光度计测定 DNA 质量。其中，阳性参考品包括：扩增型、风险型，2 个非人源大肠杆菌 DNA 与 4 个野生型共同组成阴性参考品。

1.2.2 原料验证 由中国食品药品检定研究院采用荧光定量仪对参考品所包含的阳性及阴性样本的 DNA 浓度进行测定，同时采用紫外分光光度计测定 DNA 质量。并将全部样本进行 PCR-毛细管电泳分析。

1.2.3 参考品的制备 将 10 个样本的基因组 DNA 稀释为 50 ng/μl 后分装于 0.5 ml 旋盖冻存管中。每套参考品包含 10 个样本。其中，阳性样本包括：2 种扩增型样本（CTG 重复 38～52）、2 种风险型样本（CTG 重复 ＞ 52）；阴性样本包括：4 种野生型样本、2 种非人源大肠杆菌样本。分装后的参考品放置于 -80 ℃ 超低温冰箱保存。

1.2.4 参考品的协作标定验证 选择 5 家tcf4 检测试剂盒生产或研究单位对分装后的参考品进行验证。5 家单位的检测方法包括：荧光 PCR 法、DNA 片段分析法、毛细管电泳法等。验证的性能指标包含：①准确性：检测试剂盒检测范围内的tcf4基因不同型别的 4 份阳性参考品；②特异性：检测试剂盒检测范围内的 4 份野生型阴性参考品及试剂盒检测范围外的 2 份非人源大肠杆菌样本；③检测限：在试剂盒规定的最低检测限范围内检测一套参考品所包含的共 10 份样本。

1.2.5 参考品的稳定性验证 由于参考品的保存温度为-80℃、运输温度为 -20℃，因此需要对冻融稳定性进行验证。将 1 套参考品冻融 3 次后，使用广州市达瑞生物技术股份有限公司提供的tcf4 基因 CTG 重复快速检测试剂盒（荧光 PCR 毛细管电泳法）进行冻融稳定性的实验。

2 结果

2.1 原料验证的结果

将参考品所包含的阳性及阴性 DNA 样本进行 PCR-毛细管电泳实验并采用 GeneMapper 软件进行检测结果分析，结果为：全部阳性样本及 4 种野生型样本的碱基序列与样本 CTG 重复数一致。检测的结果详见图 1、表 1。

表1 参考品基因分析结果

图1 参考品毛细管电泳结果

2.2 不同单位对参考品的协作标定结果

5 家tcf4 检测试剂盒检测及科研单位，各自采用自行生产的tcf4 检测试剂盒对本套参考品进行协作标定验证。验证结果表明参考品的组成成分合格，验证结果见表 2。

表2 5 家单位本参考品的验证结果

2.3 参考品的稳定性验证结果

将参考品冻融 3 次后，采用广州市达瑞生物技术股份有限公司提供的tcf4 基因 CTG 重复快速检测试剂盒（荧光 PCR 毛细管电泳法）进行稳定性验证。实验结果显示反复冻融对参考品的稳定性没有影响，验证结果见图 2。

图2 3 次冻融稳定性结果

3 讨论

国家参考品是体外诊断检测试剂盒研发及质量控制较为关键的一环，对产品质量、企业自检及产品上市后的国家监督抽验均是一个重要的工具[3-5]。目前，我国用于基因检测的诊断试剂盒的研发缺乏参考品的参照和指导[6]，部分企业需要花费大量精力收集并研制企业参考品用于验证试剂盒的性能指标[7]，但由于企业在临床资源、伦理审批等方面不具有优势，因此所研制的企业参考品在样本来源及覆盖度等方面均存在不足。另一方面，体外诊断试剂盒的注册需要筛选临床样本进行试验，而部分企业由于时间成本、原料成本等原因存在大样本量特别是临床阳性样本的筛选困难。企业试剂盒的检验项目及性能指标众多，部分企业无法保证稳定的临床样本来源对每一项指标进行验证[8]，因此在部分注册检验中出现了企业临时寻找临床样本以补充参考品的现象。这种临时样本缺乏连续性且验证不充分，大量的使用可能会导致对试剂盒考察水平的不一致。由于上述原因，部分试剂盒的研发企业比较关注《注册检验用体外诊断试剂国家标准品和参考品目录》的更新，当出现新的国家参考品时，企业会考虑加大相关产品的研发力度以便充分利用国家参考品全面的样本型别完成试剂盒的研发和验证。

目前，临床tcf4 的基因检测技术主要包括多重PCR[9]、毛细管电泳[10]、BSP-测序、DNA 片段分析等方法，NGS 测序不能准确地测定该基因的高 CTG 重复数变异，第三代测序技术由于成本等原因，尚未大量应用于临床检测，然而在tcf4 基因检测中，无论野生型、扩增型、风险型，国内外都缺乏统一认可的参考物质。本次研制的tcf4 国家参考品不但包含了国内常见的tcf4 突变型别，而且对参考品的验证结果表明该套参考品盘的准确性和稳定性合格，可为 FECD 相关的tcf4基因检测试剂盒（荧光 PCR-毛细管电泳法）的性能评价及临床实验室质量评价提供可靠的参考物质。