猪圆环病毒2型亚单位疫苗的研制及其ELISA抗体评价

王琳琳，方向红，夏坤，卞立平

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2.江苏省农业科学院，江苏 南京 210014）

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属其中一员，是单股环状DNA 病毒，病毒无囊膜，被认为是最小的动物病毒之一，该病毒的基因组大小有1 767 bp 或1 768 bp[1]。PCV 病毒存在3 种类型，其中PCV-1 对动物没有致病性，只有PCV-2 对动物具有致病性，感染PCV-2 病毒可以导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征及其他猪圆环病毒相关疾病[2]。近年来PCV-3被相继报道，是一种新发现的病毒，感染PCV-3 的动物临床表现为多器官炎症，包括皮炎和肾病综合症等[3]，已在美国、意大利、中国和波兰[4]相继报道。目前在我国广泛流行的PCV-2 病毒，对养猪业造成了严重的经济损失。研究表明PCV-2 含有11 个ORF，其中唯一编码的结构蛋白为ORF2 编码的核衣壳蛋白（Cap），该蛋白免疫原性较高，能诱导机体产生中和抗体，是重组疫苗研制的重要基因[5]。本试验选用PCV2 地方流行株进行了病原分离、鉴定，构建表达Cap 蛋白的重组杆状病毒，将灭活的重组杆状病毒作为抗原，采用新型水佐剂制备成灭活疫苗，开展疫苗的安全和血清ELISA效力评价，目的在于研制出对动物更安全、更有效的PCV-2 新型重组疫苗。

1 材料与方法

1.1 毒株和细胞

猪圆环病毒2 型重组杆状病毒TX01 株第5 代（F5），Sf9 昆虫细胞，由江苏农牧科技职业学院保存。

1.2 主要试剂

乙醇、异丙醇、苯酚/氯仿/异丙醇（25:24:1）等均为分析纯，购自北京化学试剂公司；PCR 扩增酶、dNTP等均购自大连宝生物工程有限公司；猪圆环病毒2 型抗体检测试剂盒，购自韩国金诺（MEDIAN）诊断试剂株式会社；细胞培养基Sf900-II培养基，购自Invitrogen生命技术公司；PCV2 荧光抗体，购自VMRD 公司；BCA 蛋白含量测定试剂盒购自Thermo Fisher 公司；Hyclone 胎牛血清购自Thermo；水性佐剂，购自法国SEPPIC 公司。

1.3 试验动物

PCV2 抗原、抗体均为阴性的2～4 周龄健康仔猪，购自泰州某养殖场，专人管理、定时饲喂。

1.4 抗原液制备

1.4.1 制备抗原液 取长成良好的单层Sf9 细胞，按照MOI 为0.3 接种猪圆环病毒2 型重组杆状病毒（TX01 株），27 ℃培养5～7 d 后，至细胞病变达80%以上时，15 ℃冻融1～2 次后，收获病毒液，置于15 ℃条件下保存备用。采用此方法连续制备3 批抗原液，同时抽样进行无菌检验。

1.5 PCV2灭活疫苗制备

PCV2 抗原除杂后用Tris-NaCl 缓冲液稀释至40g/mL，用于疫苗配制。疫苗配比为PCV2 抗原与佐剂比例为4:1（v/v），将佐剂加入水相中，转速250～550 r/min，均匀搅拌45 min，充分混匀。无菌定量分装，加盖密封，于2～8 ℃条件下保存。

1.6 PCV2灭活疫苗安全性评价

试验筛选3 周龄健康易感仔猪5 头，接种实验室制备的PCV2 灭活疫苗，颈部肌肉注射4.0 mL/头（2倍剂量），设立阴性对照组，不接种疫苗，疫苗接种后连续观察21 d，试验结束后称重，对比免疫组和对照组的日增重，观察免疫后仔猪精神、食欲和行为活动，检查注射部位疫苗吸收情况是否良好，观察全身及局部是否有不良反应。

1.7 PCV2灭活疫苗免疫仔猪后ELISA抗体检测

选择健康易感仔猪10 头（21日龄）作为试验动物，随机分为2 组。每组5 头猪。第1 组，接种PCV2灭活疫苗，颈部肌肉注射2.0 mL/头。第2 组为空白对照组，不做任何处理。疫苗免疫后每隔7 d 采血，至免疫后21 d，分离血清，用ELISA 抗体试剂盒检测血清中PCV2 抗体效价。

2 结果与分析

2.1 免疫后临床观察

疫苗免疫后，仔猪精神、食欲和行为活动均正常，用手触摸注射部位，未见红肿、化脓等不良症状出现，与对照组仔猪无差别。

表1 PCV2 疫苗免疫接种后临床观察结果Table 1 Clinical observation of piglets after immunization with PCV2 vaccine

2.2 免疫后体温变化

疫苗免疫后，免疫组仔猪体温正常，与对照组仔猪相比无显著差异（P＞0.05），均无临床发热的情况。

2.3 免疫后日增重

表2 PCV2 疫苗免疫后仔猪体温测定结果Table 2 Temperature measurement results of piglets after immunization with PCV2 vaccine（℃）

疫苗免疫组仔猪的日增重平均值为0.282 kg，与对照组无显著差异（P＞0.05），见表3。

表3 PCV2 疫苗免疫后仔猪体重变化Table 3 Daily weight gain of piglets after immunization with PCV2 vaccine

2.4 PCV2 ELISA抗体水平

疫苗免疫后，免疫组仔猪21日ELISA抗体效价在1:400～1:800 之间。对照组仔猪抗体水平均低于1:50，结果见表4。

表4 疫苗免疫后仔猪PCV2 ELISA 抗体检测结果Table 4 ELISA antibody detection results of piglets after immunization with PCV2 vaccine

3 讨论

近年来在我国广泛存在猪圆环病毒2 型感染的相关疾病，为养猪业带来巨大的经济损失。PCV2 除了导致断奶仔猪引发PMWS 外，还会导致淋巴系统免疫抑制，使其他病毒或细菌继发感染[6]，但现在还没有特效药治疗该病，疫苗免疫接种是当前最重要的防控手段。目前，在我国应用的商品化疫苗主要以灭活疫苗为主，但是传统的PCV2 灭活疫苗仍存在一定的缺陷，如抗原制备、抗体滴度和免疫效果等方面尚有待提高，而Cap 蛋白作为唯一的结构蛋白，可以诱导PCV2 中和抗体，产生良好的免疫原性，PCV2 亚单位疫苗因其具有较好的安全性、良好的免疫效果和经济性等优势而成为近年来研制该疫苗的热点[7]。国内外利用Cap重组蛋白免疫实验动物开展的免疫原性实验证实，Cap重组蛋白具有一定的免疫原性。金宁一等[8]用pVAX I真核表达系统表达Cap 蛋白，用构建的PCV2 Cap 基因重组质粒在小鼠体内开始体内免疫试验，结果表明，该质粒能在免疫后50 d时产生较高的抗体效价，说明Cap 蛋白能够激发小鼠机体产生一定体液免疫应答。李天增等[9]利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型重组Cap 蛋白的高效表达，然后对表达的重组蛋白进行纯化，将纯化后的重组蛋白免疫豚鼠后诱导机体产生一定的PCV2 抗体，表明纯化的PCV2-rCap 蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2 亚单位疫苗研发候选抗原。张艳艳等[10]利用杆状病毒表达系统高效表达猪圆环病毒2 型Cap 蛋白，该重组蛋白免疫小鼠后可激发小鼠较高的体液免疫应答，为PCV2 疫苗的研制提供了理论依据。

本研究选取本地流行毒株PCV2 TX01 株，通过杆状病毒表达载体表达Cap 蛋白，直接反复冻融感染嵌合Cap 的杆状病毒的细胞，Cap 蛋白的表达浓度可达200g/mL。本研究仅通过简单过滤细胞裂解液并灭活杆状病毒后，与进口水性佐剂混合，制备成灭活疫苗，省去了纯化繁琐的步骤，将Cap 蛋白免疫仔猪后，观测仔猪临床症状，仔猪精神、食欲和行为活动均正常，接种部位未见红肿、化脓等不良症状，证实疫苗对仔猪安全，无不良反应。免疫后仔猪日增重与对照组无显著差异。免疫组仔猪ELISA 抗体效价在1:400～1:800 之间，说明疫苗免疫后可以有效的刺激仔猪产生体液免疫，下一步对免疫攻毒保护进行研究，对疫苗免疫的效力做进一步的验证。

综上所述，本研究采用重组杆状病毒表达PCV2Cap蛋白，利用新型佐剂制备的新型PCV2 基因工程亚单位疫苗，免疫仔猪后可诱导产生较高水平的体液免疫应答，可作为防控猪圆环病毒病的候选疫苗，对实际生产具有广泛的应用价值。