基于网络药理学分析苦豆子生物碱抗肺癌的作用机制

李静静，王福玲，李嘉欣，吴思雨，王群，贾绍华

（1.哈尔滨商业大学英才学院，黑龙江 哈尔滨 150076；2.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

肺癌指发生于肺部的恶性肿瘤，常发生于支气管表皮的上皮细胞，是全世界高死亡率的癌症之一。尽管顺铂介导的化疗依然是治疗肺癌的必要手段，但目前由于其在临床上经常出现耐药性和不良反应强烈等问题，急需一种可以减缓或克服上述不良反应的方法[1]。中药苦豆子（Sophora alopecuroides L.）为豆科槐属多年生草本植物的干燥全草及种子，性寒，味苦，具有清热解毒、抗菌消炎及止痛镇静等功效。现代研究表明，苦豆子具有抗肿瘤、增强免疫、抗炎、抑菌和保护心血管系统等药理作用，其中，苦豆子中的生物碱成分是其发挥抗肿瘤作用的主要有效成分[2]。本文从网络药理学角度初步预测苦豆子生物碱抗肺癌的可能机制，为苦豆子的临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 化学成分筛选

对苦豆子生物碱成分进行检索搜集，得到21 种有效生物碱成分[3,4]，运用ChemDraw18.0 对这21 种生物碱成分进行绘制并保存为MDL SDfile（*.Sdf）格式备用。

1.2 苦豆子生物碱成分潜在靶点的预测与筛选

将绘制好的21 种苦豆子生物碱成分分别上传到SwissADME对其类药性和药代动力学进行预测分析，均符合标准。在SwissTarget Prediction 数据库中，分别对这21 种成分进行靶点预测，并以Probability*值进行筛选（取0.3＜Probability＜1）。

1.3 肺癌基因靶点预测

在GeneCards 和DisGeNET 数据库中设定物种为‘Homo sapiens’，进行肺癌疾病靶点的搜集，并将所得到的靶点合并、去重，将苦豆子生物碱的基因靶点和肺癌基因靶点导入韦恩图中取交集，得到共同基因，即为苦豆碱潜在的抗肺癌的核心靶点。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建和通路富集分析

将1.3 中获得的交集基因导入STRING 数据库进行PPI 网络的构建，并在Metascape 数据库中进行KEGG 和GO 分析。

1.5 构建苦豆子生物碱 靶点 通路网络

将搜集到的21 种苦豆子中主要生物碱成分及其靶点信息和通路导入Cytoscape 中，构建苦豆子生物碱 靶点 通路网络。

2 结果与分析

2.1 潜在靶点与成分分析

21 种苦豆子生物碱成分，见表1，共170 个靶点基因，取度值（Degree值）大于10 的基因进行分析，共得到靶点蛋白22 个。

表1 苦豆子中有效生物碱成分的化学式Table 1 Information on the chemical components of active alkaloids inalopecuroides

续表

2.2 疾病相关靶点筛选

检索GeneCards 和DisGeNET 数据库中的肺癌基因并去重，共得到肺癌相关基因靶点453 个。将上述得到的170 个苦豆碱的基因靶点和453 个肺癌基因靶点导入韦恩图中取交集，最后得到核心靶点18个，见图1。

图1 苦豆子生物碱成分靶点与肺癌相关靶点的韦恩图Fig.1 Venn plot of alkaloids inalopecuroides targets and lung cancer-related targets in seeds

2.3 蛋白互作网络分析

在苦豆子生物碱抗肺癌蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）中选取置信度大于0.4 部分，结果见图2。由图2可知，在苦豆子靶蛋白PPI 网络中CYP（细胞色素P450）家族所占比例最大，其次是CHRNA（神经酰胺受体）家族与表皮生长因子家族（EGFR和雄性激素受体AR），提示有关这几种家族的靶点在治疗肺癌的过程中发挥的药理作用明显。

图2 苦豆子靶蛋白PPI 网络Fig.2 PPI network of the alkaloids inalopecuroides.

2.4 代谢通路分析

用Metascape数据库对核心靶点进行通路代谢分析，取lgP＞-0.8 的15条通路进行分析，并绘制气泡图（见图3）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析表明癌症通路、药物代谢和细胞色素P450 对异源物的代谢及胆碱能突触等代谢通路与苦豆子对肺癌的治疗作用有关，参与癌症信号通路的关键靶点有6 个，分别是AR、EGFR、ESR2、IGF1R、JAK2和ROCK1，提示这几种靶点在治疗肺癌的过程中发挥的药理作用明显。

图3 活性靶点KEGG 代谢通路气泡图Fig.3 Bubbles of active target KEGG metabolic pathway

2.5 GO富集分析

基因本体（Gene Ontology,GO）由分子功能、生物过程和细胞组分3 个部分组成[5]。选取部分苦豆子生物碱活性靶蛋白的富集结果（均选取P＜0.01、基因数量＞3 和富集因子百分比＞1.5）进行GO 富集分析并绘制条形图（见图4）。结果表明，苦豆子生物碱抗肺癌主要与细胞对激素刺激的反应、氧化应激反应及花生四烯酸代谢等生物过程有关。

图4 苦豆子生物碱治疗肺癌活性靶点GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of active targets ofalopecuroides in the treatment of lung cancer

2.6 构建苦豆子生物碱 靶点 通路网络

将搜集到的21 种苦豆子生物碱成分所对应的170个核心靶点和15 条通路导入Cytoscape 中，构建苦豆子生物碱 靶点 通路网络，见图5。该网络共有节点206 个，边873 条，其中，槐定碱（sophoridine）及其衍生物（KD01、KD02）、槐胺碱（sophoramine）及其衍生物（KD07）以及金雀花碱（cytisine）等可作用于CHRNA（神经元乙酰胆碱受体亚基）、HTR3A（5-HT3a受体）、HDAC（组蛋白脱乙酰酶）和CYP（细胞色素P450）等22 个苦豆子抗肺癌的关键靶点，提示这些化学成分可能通过作用于这些靶点参与苦豆子治疗肺癌的过程。

图5 苦豆子生物碱 靶点基因 代谢通路网络Fig.5 The alkaloids inalopecuroides-target-metabolic pathways network

3 讨论

本研究采用网络药理学的方法，探索了苦豆子生物碱抗肺癌中多成分、多靶点及多渠道的复杂网络关系。从苦豆子中筛选出21 种生物碱成分，在网络药理学的基础上推测槐定碱、金雀花碱、苦参碱和苦豆碱等生物碱是苦豆子抗肺癌的主要活性成分，确定CHRNA、HTR3A、HDAC 和CYP 等22 个苦豆子抗肺癌的关键靶点；结合苦豆子靶蛋白PPI、KEGG 和GO 分析，确认CYP、EGFR 等相关蛋白靶点在肺癌的治疗过程中发挥主要作用。

实验证实槐定碱能够以浓度依赖的方式减少MDM2 介导的P53 蛋白泛素化以及稳定P53 蛋白，从而激活P53 信号通路；也可激活肺癌细胞中的Hippo途径从而产生抗肿瘤作用；当槐定碱与顺铂合用时，槐定碱可以增加肺癌细胞对顺铂的敏感性，减少肺癌病人在治疗过程中耐药性的产生改善顺铂在体内的抗肿瘤功效[1]。金雀花碱是四环喹诺里西啶结构，具有较强的抗肿瘤作用，较低浓度时即可对肺癌细胞产生较大的杀伤作用，且对正常的肺部细胞的影响作用很小。有文献证实，槐定碱、金雀花碱均可通过上调肺癌细胞中ROS（活性氧）水平，调控AKT/NF- B 信号通路，使AKT 磷酸化水平下调，诱导细胞线粒体依赖性凋亡，从而使细胞产生G2/M 周期阻滞，抑制肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[6,7]。

苦参碱可以抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的活性，从而抑制肺癌细胞增殖并诱导细胞自噬和凋亡。苦参碱对肺癌细胞的抑制作用主要是由于细胞周期阻滞引起的，包括细胞生长周期延长和增殖减速，同时，也可增加肺癌细胞中miR-126 含量[8]。CYP通常参与抗癌药物的激活和失活，有时也仅参与抗癌药物的失活，表明肺癌及其周围组织中局部CYP 的表达可能是抗癌药物疗效的重要决定因素[9]。实验结果表明，苦参碱和氧化苦参碱可以剂量依赖性调控CYP2B1 的活性和基因表达，且可以激活CAR（人的组成型雄甾烷受体），诱导CYP2B 报告基因构建，CYP2D6 与CYP2B 同属参与治疗药物代谢酶CYP450 超家族成员，是某些环境因子诱发疾病的潜在易感因子，研究表明，CYP2D6 的遗传多态性增加其对多种癌症的易感性[10,11]。简而言之，苦参碱和氧化苦参碱可以通过某种机制调节CYP 的表达而调控人体对肺癌的易感性及抗癌药物的药效。

苦豆碱可与表达p14ARF/p53 的腺病毒载体联合治疗，产生协同作用，使非小细胞肺癌细胞产生G1 周期阻滞，诱导细胞凋亡，抑制肺癌细胞增殖[12]。

尼古丁可以通过激活7-烟碱型乙酰胆碱受体（ 7-nAChR），促进支气管上皮细胞释放EGF，其与EGFR 结合后可以激活AKT 和MEK-ERK 信号通路，从而促进癌细胞增殖，表明靶向7-nAChR 的药物及其受体拮抗剂可以抑制肺癌细胞的生长[13]。HTR3A是5-HT3 受体的主要亚基，细胞表面的5-HT 受体可以激活大脑中的ERK 信号级联，进一步促进ERK1/2磷酸化，促进肺腺癌细胞增殖[14]，说明抑制HTR3A的表达在某种程度上也可抑制肺癌细胞的增值。CREBBP 是编码乙酰转移酶的基因，是小细胞肺癌中最常见的突变基因之一，小细胞肺癌中CREBBP的缺失可降低其组蛋白乙酰化和细胞黏附基因的转录，驱动肿瘤发生。而这些作用可以通过抑制HDAC基因而部分恢复，表明HDAC抑制剂可以选择性治疗由CREBBP突变引起的小细胞肺癌[15]。

综上所述，苦豆子中含有的生物碱成分——槐定碱、金雀花碱、苦参碱、氧化苦参碱和苦豆碱等是苦豆子治疗肺癌的主要有效成分，分别通过调节细胞中ROS含量、调控miRNA编码以及调节CYP、CHRNA、HTR3A 和HDAC 等核心靶点，引起P53、Hippo 和PI3K/AKT/mTOR 等信号通路的激活或抑制，达到治疗肺癌的目的。本研究通过网络药理学的方法，初步探究了苦豆子抗肺癌的活性成分、关键靶点和信号通路，为苦豆子生物碱抗肺癌机制研究提供了理论依据和线索，其预测结果有待进一步验证。