基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的赣南地区产铁皮石斛茎和根水提物的成分表征

谢树春，李小军，程齐来，范平龙

（1.赣南医学院2021级硕士研究生；2.赣南医学院药学院，江西 赣州 341000）

兰科石斛属铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo），为2020年版《中国药典》中药品种铁皮石斛的基原植物，具有“益胃生津，滋阴清热”的功效，中医临床用于热病伤津、口干烦渴、胃阴不足、食少干呕、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软等病症［1］。唐代医学典籍《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草之首”，历来受人追捧。现代药理研究表明，铁皮石斛具有增强免疫功能［2］、抗肿瘤［3］、延缓衰老［4］、抗疲劳［5］、降血糖［6］、改善胃肠功能［7］等作用。从我国铁皮石斛产量分布来看，铁皮石斛主要分布在浙江、云南、广东、广西等地，其中浙江省铁皮石斛的产量最多，占42%，其次是云南省，占28%［8］。江西省铁皮石斛的规模种植在2010年以前就已出现，主要途径是由浙江投资者在我省建立的苗木基地引进铁皮石斛种植［9］。野生铁皮石斛对生长环境的温度、湿度、水源等条件有着苛刻要求，而仿野生栽培的兴起，加上赣南地区自然环境适合铁皮石斛的仿野生栽培，铁皮石斛种植得以在赣南地区迅速发展。

铁皮石斛主要开发利用部位是茎，富含多糖、生物碱、有机酸、黄酮类等成分［10］。铁皮石斛药用资源中还有小量的根、叶和花等组成，但迄今为止，文献对铁皮石斛根、叶、花的研究报道较少、较浅，特别是对铁皮石斛根的化学成分研究及药理研究十分匮乏。因此，在采收时，大量的根作为药材废弃物直接丢弃，造成了一定的生物资源浪费。为了提高铁皮石斛植物资源的综合利用度，加上目前对赣南地区产铁皮石斛化学成分研究资料空白，本实验采用超高效液相色谱-四级杆-静电轨道串联高分辨质谱法（UPLC-QE-Orbitrap-MS）对赣南地区产铁皮石斛茎和根的化学成分进行定性分析，初步比较二者成分差异，以期为进一步中药成分体内代谢研究及药效物质研究奠定基础，为后续进一步扩大药用部位提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器Ultimate 3000 RS型超高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Q Exactive高分辨质谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Direct-Q®5纯水/超纯水一体机系统，德国默克密理博；MS105DU半微量电子天平，梅特勒·托利多国际贸易有限公司；D3024R速微量冷冻离心机，北京大龙兴创实验仪器有限公司；MX-F涡旋振荡器，武汉赛维尔生物科技有限公司；MTV-100多管涡旋混合仪，杭州奥盛仪器有限公司；JP-040S超声波清洗器，深圳洁盟清洗设备有限公司。

1.2 材料铁皮石斛，2020年12月采集于江西省龙南市江西新灵倍康石斛科技有限公司铁皮石斛种植基地。药材样本由赣南医学院药学院程齐来教授鉴定为铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo），凭证标本（GY2020125YC）保存在赣南医学院药学院中药标本馆。色谱纯甲醇、甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），其他所用试剂均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。

2 实验方法

2.1 供试品溶液制备将采集的鲜药铁皮石斛分离茎和根，去除杂质，阴干。茎和根分别进行粉碎，加10倍量蒸馏水浸泡1 h，煮沸提取2次，每次2 h，抽滤得提取液，合并2次提取液。所得提取液，浓缩至5倍水体积，3 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，减压浓缩并进行真空冷冻干燥，分别得到铁皮石斛茎和根的冻干水提物。精密称取10 mg的冻干水提物样本，加入80%甲醇1 mL，研磨5 min，再涡旋5 min，4℃条件下离心10 min，离心力20 000×g，取上清，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液，每组平行设置3个重复，放置4℃冰箱备用。

2.2 色谱条件Welch Ultimate XB-C18型色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1 min，2%A；1～5 min，2%～20%A；5～10 min，20%～50%A；10～15 min，50%～80% A；15～20 min，80%～95% A；20～25 min，95% A；25～26 min，95%～2% A；26～30 min，2% A）；流量：0.3 mL·min-1；柱温箱温度：35.0℃；自动进样器温度：10.0℃；自动进样器进样体积量：5.00 μL。

2.3 质谱条件采用电喷雾离子源（ESI），在正负离子切换扫描模式下分别进行质谱检测分析。扫描模式：Full mass/dd-MS2，Full mass分辨率为70 000，dd-MS2分辨率为17 500；扫描范围：150.0～2 000 m·z-1；电喷雾电压：3 800 V（Positive）；毛细管温度：300℃；碰撞气：高纯氩气（纯度≥99.999%）；鞘气：氮气（纯度≥99.999%），40 Arb；辅 助 气：氮 气（纯 度≥99.999%），350℃；数据采集时间为30 min。

2.4 数据分析UPLC-QE-Orbitrap-MS采集的数据通过CD2.1（Thermo Fisher）完成数据初步整理后进行数据库检索比对（mzCloud，mzVault），筛选出赣南地区产铁皮石斛茎和根可能存在的化合物。在此基础上，利用Thermo Xcalibur 2.2分析软件对质谱数据进一步分析和处理，并结合相关参考文献推导拆分碎片，最终确定赣南地区产铁皮石斛茎和根的化合物。得到的数据输入SIMCA-P 14.1软件进行无监督的主成分分析（PCA），从总体上得到茎和根之间的总体成分差异和变异度大小，并使用Draw Venn Diagram软件对根和茎化学成分进行Venn差异分析。

3 结果

3.1 赣南地区产铁皮石斛茎和根的化学成分定性分析本实验基于UPLC-QE-Orbitrap-MS技术对赣南地区产铁皮石斛茎和根的水提物进行化学成分表征，通过比较赣南地区产铁皮石斛茎和根的总离子流图（见图1），发现茎和根间成分种类差异较小。从两个不同部位总离子流图中分离出598个质量峰，结合参考文献和mzCloud数据库，综合考虑保留时间、分子式、精确分子量、特征性离子碎片，分别鉴定了29个共有化学成分（包括12个有机酚酸类、10个黄酮类、3个核苷类、3个脂肪酸类及1个酰胺类物质，见表1）和5个差异化学成分（根：3个有机酸类、1个黄酮类；茎：1个脂肪酸。见表2）。

表1 赣南地区产铁皮石斛茎和根水提物中29个共有化合物的定性分析结果

表2 赣南地区产铁皮石斛茎和根水提物中5个差异化合物的定性分析结果

图1 赣南地区产铁皮石斛茎（A）和根（B）的水提物UPLC-QE-Orbitrap-MS总离子流图

3.2 赣南地区产铁皮石斛茎和根差异成分分析利用SIMCA-P 14.1软件对预处理后的数据进行PCA分析及Draw Venn Diagram软件进行Venn差异分析，筛选差异成分。通过PCA主成分分析得分散点图，能够直观地显示出二者之间的整体差异，结果见图2。横坐标为描述多维数据矩阵中最显著的特性；纵坐标为除横坐标以外的所能描述多维数据矩阵中最显著的特性。在横坐标上，根和茎并未明显分离，这说明两个部位不同化学成分种类的差异并不明显。在纵坐标上，茎与根明显分离，且茎、根分别分布在不同侧，这说明部位之间的化学成分含量是第二显著的特性，二者成分含量相差较大。使用Draw Venn Diagram软件对二者成分进行差异分析发现，茎和根有520个共有质量峰，18个茎特有质量峰和60个根特有质量峰，进一步表明二者成分种类大致相同（见图3）。

图2 赣南地区产铁皮石斛茎和根水提物成分的PCA分析

图3 赣南地区产铁皮石斛茎和根水提物成分的Venn差异分析

4 讨论

铁皮石斛属于名贵中草药，资源短缺，且铁皮石斛根为气生根，杂质污染少，较易净制，民间用于食疗较广泛。浙江、福建等地民间常将铁皮石斛根洗净晒干，煲汤服用，亦有酿酒时掺入进行发酵，取其保健功效。因此，对铁皮石斛根部的物质基础进行系统研究，为铁皮石斛根的进一步开发利用提供科学依据具有重要意义。本研究采用UPLC-QE-Orbitrap-MS技术对赣南地区产铁皮石斛根和茎水提物的主要化学成分进行了全面表征。通过参考已有的铁皮石斛化学成分研究报道［11-16］并结合mzCloud数据库检索比对，共鉴定出29个共有化合物、4个根差异化合物及1个茎差异化合物。对铁皮石斛茎和根水提物化学成分进行Venn差异分析，茎水提物的差异成分有18个，根水提物的差异成分有60个，主要为有机酸和黄酮类。二者化学成分种类差异较小，成分相似，表明铁皮石斛根进一步开发其食疗、药用等功能具有可行性。