子宫内膜癌合并糖尿病患者PAX8的表达及意义

胡珊，杨丰美，高波

(十堰市太和医院，1.妇产科；2.检验科，湖北 十堰 442000)

子宫内膜癌(uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%～30%，以发生于子宫内膜腺体的腺癌最常见[1]。近年来全世界范围内的发病率呈逐渐上升趋势，且恶性程度高，预后较差，寻找早期诊断和预后的指标尤为重要[2]。配对盒基因8(paired-box 8，PAX8)属于PAX蛋白家族，在胚胎发育、中枢神经系统、血管生成、免疫调控及肿瘤转移等方面均发挥重要作用[3]；同时又属于限制性转录因子，参与细胞增殖与分化等生理活动，与多种肿瘤比如肺癌、卵巢癌、乳腺癌等的发生、发展密切相关[4-7]。但PAX8在女性生殖系统肿瘤，特别是在UCEC中的作用研究较少。本研究旨在探讨PAX8在UCEC中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

UCEC配对样本(肿瘤组织样本及匹配的正常组织样本各23例)和非配对样本(肿瘤组织样本174例，正常组织样本91例)来自TCGA数据库和GTEx数据库；UCEC患者的临床资料从TCGA数据库中下载。

1.2 方法

1.2.1 PAX8 表达及与临床病理特征的相关性分析 采用R语言分析配对样本和非配对样本中PAX8基因的表达情况；免疫组化法分析HPA在线数据库中PAX8蛋白在UCEC癌组织和正常组织中的表达情况；同时分析PAX8表达与临床病理特征的相关性。

1.2.2 PAX8表达与UCEC预后的相关性分析 分析UCEC的临床资料，并将临床资料(临床分期、年龄、组织类型、组织分级、浸润程度等)与PAX8表达等因素一起构建Cox模型，单/多因素回归分析影响UCEC预后的因素，同时通过K-M plotter数据库分析并绘制PAX8表达在UCEC患者中的生存曲线。

1.2.3 临床样本PAX8基因表达检测 收集2019年8月至2021年5月新鲜的子宫内膜癌组织样本47例，正常子宫内膜样本23例，所有样本均经病理确诊。TRIzol法提取所有样本中总RNA，逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientifc)将RNA逆转录为cDNA，测定浓度纯度后-80 ℃保存备用。扩增引物(PAX8)：5′-ATCCGGCCTGGAGTGATAGG-3′，5′- TGGCGTTTGTAGTCCCCAATC-3′；扩增引物(GAPDH)：5′-GAAGGTGAAGGTCGGA GTC-3′，5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。扩增条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s共35个循环； 72 ℃ 8 min，2-△△Ct计算基因相对表达水平。

1.2.4 子宫内膜癌患者血糖检测 所有患者空腹抽取外周血5 mL置于无抗凝剂的试管中，37 ℃静置1 h后离心获取血清，测定完血糖水平后剩余血清保存于EP管中-80 ℃备用。血糖的检测在AU2700全自动生化仪上进行，采用配套试剂，检测前定标，空腹血糖正常参考范围为3.9～6.1 mmol/L。所有患者通过询问糖尿病病史以及测定空腹血糖判定是否为子宫内膜癌合并糖尿病患者。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PAX8在癌组织和正常组织中的表达

R语言及免疫组化分析结果显示，PAX8及蛋白质在癌组织中的表达高于正常组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2 PAX8表达与临床病理特征的关系

相关性分析显示，PAX8的表达在临床分期(III+IV)、年龄(≥60岁)、组织分期(混合型&浆液性)、组织分级(G3)、浸润深度(>50%)及DSS事件(死亡病例)中的表达更高(P<0.05)。见图2。

2.3 UCEC预后的影响因素

单因素回归分析显示，临床分期、年龄、组织分型、组织分级、肿瘤浸润及PAX8表达是影响患者肿瘤总生存期(OS)的因素；临床分期、组织分型、组织分级、肿瘤浸润及PAX8表达是影响患者无进展生存期(PFS)的因素。多因素回归分析显示，临床分期、肿瘤浸润及PAX8表达是影响患者OS的因素；临床分期、组织分级及PAX8表达是影响患者PFS的因素。根据PAX8表达不同分为高表达组和低表达组，低表达组患者OS长于高表达组(四分位生存时间103.4个月vs.31.8个月)；合并糖尿病的UCEC患者中，低表达患者OS长于高表达患者(P<0.05)，而其他临床亚组无统计学差异(P>0.05)。见图3及图4。

2.4 临床样本中PAX8基因表达结果及与临床病理特征之间的关系

为了验证生物信息学分析结果，本研究检测了47例UCEC患者肿瘤组织及23例正常子宫中PAX8的表达及UCEC患者血糖水平。相关性分析结果显示，PAX8的表达与是否合并糖尿病有关(P<0.05)，而与年龄、身体质量指数、高血压以及分期无关(P>0.05)。PAX8在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织(0.51±0.25vs.0.25±0.10，P<0.05)；合并糖尿病患者中的表达高于非糖尿病患者(P<0.05)；合并糖尿病患者中的血糖水平高于非糖尿病患者(P<0.05)，PAX8高表达患者的血糖水平高于低表达患者(P<0.05)。见表1及图5。

表1 PAX8表达与临床病理特征的关系

3 讨论

生物信息学是对组学的各种数据进行处理和分析，可以对已知或新的基因产物进行全面分析。随着计算机技术和生物技术的快速发展，生物信息学技术对了解和探究疾病的发病发挥了重要作用。作为一种女性生殖系统常见的恶性肿瘤，UCEC近年来的发病率呈逐渐上升趋势，且由于缺乏特异性的早期诊断指标，导致预后较差。PAX基因是一组发育性转录因子，是正常组织形成和细胞分化的关键调控因子[8]，在多种实体肿瘤中异常表达。

本研究发现，PAX8在癌组织中高表达，特别是在分期(III+Stage IV)、年龄(≥60岁)、组织分期(混合型&浆液性)、组织分级(G3)、浸润深度(>50%)等临床患者中(均P<0.05)。回归分析发现，临床分期、组织浸润和PAX8表达是影响子宫内膜癌患者预后的因素，特别是低表达患者有着较好的预后(P<0.05)。有研究[9]表明，MACC1-AS1的高表达可以增强肝癌细胞中PAX8的表达，且MACC1-AS1的高表达可以通过调节PAX8进而促进肝癌细胞的增殖、上皮间质转化和侵袭。PAX8在高级别浆液性卵巢癌中普遍表达，其沉默可以减少人高级别浆液性卵巢癌细胞系的增殖，增加凋亡[10]。由于PAX8在高级别浆液性卵巢癌中介导多种致瘤机制，包括增殖、迁移、血管生成和凋亡等，降低PAX8水平或中断PAX8的转录活性可以抑制这些癌前效应[5,11]，为PAX8在肿瘤发生发展过程中所起到的促进作用提供了证据。

分析临床亚组中PAX8的表达与预后关系发现，糖尿病患者中，低表达患者同样也有较好的预后(P<0.05)。通过临床样本验证发现，在合并糖尿病患者中PAX8的表达水平相对较高(P<0.05)，且高表达的患者有相对较高的血糖水平(P<0.05)，进一步表明在UCEC的预后过程中，PAX8的表达和血糖水平起着重要的作用，但两者之间的关系及机制还需要进一步研究。糖尿病是UCEC较为常见的发病因素，且合并2型糖尿病也是雌激素依赖型UCEC患者预后不良的因素[12]。有研究[13]表明，PAX8在妊娠小鼠胰岛和重组催乳素处理的人胰岛中被诱导， PAX8表达的增加影响胰岛活力，存在PAX8的基因突变的孕妇有发生妊娠糖尿病的风险。

综上，PAX8的高表达可能在UCEC特别是在合并糖尿病的患者预后过程中起着重要的作用。