信息熵赋权结合响应面法优化石菖蒲挥发油的高速剪切包合工艺

邓桂海，胡懿，余欣彤，林嘉明，王瑜婷，曹嵌，王寿富

（广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244）

石菖蒲为天南星科石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott的干燥根茎，性温，味辛、苦，归心、胃经，具有开窍豁痰、醒神益智、化湿开胃的功效，临床广泛用于神昏癫痫、健忘失眠、耳鸣耳聋、脘痞不饥、噤口下痢等症[1-2]。现代研究表明，石菖蒲的主要药效成分为苯丙素类和萜类化合物等挥发性成分，以及生物碱类、醛和酸类、醌和酮类等非挥发性成分[3-4]。挥发油主要含有β-细辛醚、α-细辛醚等，在神经系统、心血管系统以及免疫系统中发挥广泛且重要的药理作用[5]。

由于大多数挥发油具有不稳定、易挥发、刺激性强等特点，为了提高挥发油在制剂产品中的稳定性，常采用β-环糊精包合技术对其进行处理。目前，高速剪切技术广泛应用于有效成分的提取制备[6-7]，挥发油包合物的制备方法主要为饱和水溶液法、胶体磨法等[8-9]，高速剪切包合法却鲜有报道。高速剪切技术通过转子高速旋转产生的高剪切线速度和高频机械效应带来的强劲动能，使物料从转子下端吸入及从定子喷出，从而实现液力剪切、离心挤压、液层摩擦、撞击撕裂和湍流等协同作用。高速剪切包合与传统包合方法相比，具有耗时短、节能、包合率高等特点[10]。

本研究以β-环糊精为包合材料，基于信息熵赋权原理结合响应面法对高速剪切法制备石菖蒲挥发油包合物的工艺进行优化，建立石菖蒲挥发油包合工艺的数学模型和设计空间，以实现包合物质量符合包合物得率、有效成分包合率的要求，并通过傅里叶变换红外光谱法对包合物质量进行验证，以期为石菖蒲挥发油相关制剂的研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

JRJ300-S 型数显高速剪切乳化机（上海平轩科学仪器有限公司）；Agilent 1290 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Spectrum 100 型傅里叶变换红外光谱仪（美国Perkinelmer 公司）；Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国Merck公司）；XP26型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；B-290型喷雾干燥仪（瑞士Buchi公司）；JJ2000B 型百分之一天平（常熟市双杰测试仪器厂）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与试药

β-细辛醚对照品（批号：112018-201601，纯度：99.3%）购自中国食品药品检定研究院；β-环糊精（批号：FH2106006）购自孟州市华兴生物化工有限责任公司；甲醇（色谱纯）购自德国Merck公司；水为超纯水，其他试剂为分析纯。

石菖蒲挥发油（批号：TC2103046，β-细辛醚质量分数：32.32%）由广东一方制药有限公司制备。

2 方法与结果

2.1 包合物的制备

按比例精密称取一定量的β-环糊精并加一定量的水在常温下溶解，吸取适量的石菖蒲挥发油，按挥发油与无水乙醇质量比为3∶2的比例加无水乙醇稀释，缓慢滴加到β-环糊精溶液中，常温下以一定的剪切转速剪切一定时间，喷雾干燥，收集喷干粉，混匀，即得[11]。

2.2 挥发油得率、包合率的测定

测定各试验组包合物得率（Y1）、包合物中指标性成分β-细辛醚的包合率（Y2），计算公式分别如下：

Y1=包合物质量/（β-环糊精加入量+挥发油加入量）×100%，

Y2=包合物中β-细辛醚质量/（挥发油加入量×挥发油中β-细辛醚含量×包合物得率）×100%[12]。

2.3 各指标权重系数及综合评分的计算

运用熵权法计算各评价指标的权重系数（Wi）并计算综合评分（M），建立原始评价指标矩阵X=（Xij）mn，根据公式（1）进行处理得概率矩阵P=（Pij）mn。

根据公式（2）计算各指标的信息熵Hij，根据公式（3）计算其权重系数Wj。

若某个指标的信息熵越小，表明该指标的离散程度越大，所提供的信息量越大，其权重也相应越大，在综合评分中所起的作用也越大[13]。根据包合物得率、β-细辛醚包合率的权重系数W1、W2，按公式（4）计算综合评分（M）。

2.4 β-细辛醚质量分数测定方法

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Waters HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流动相为甲醇-水（体积比55∶45）；检测波长为252 nm；柱温为40 ℃；流速为0.2 mL/min；进样量为1 μL[14]。

2.4.2 对照品溶液的制备 取β-细辛醚对照品适量，精密称定，置25 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度为650.971 μg/mL的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取包合物适量，约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 专属性考察 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂适量，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果表明β-细辛醚的专属性较强，空白溶液无干扰。

图1 专属性试验HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of specificity test

2.4.5 线性关系考察 精密吸取“2.4.2”项下对照品溶液，用甲醇稀释成6个不同浓度的对照品溶液，分别按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录相应峰面积，以各成分对照品质量浓度（μg/mL）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程为Y=15.515 0X-88.316 4，r=0.999 8，表明β-细辛醚在23.159～650.971 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.4.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得β-细辛醚峰面积的RSD 为0.69%，表明仪器精密度良好。

2.4.7 重复性试验 取同一批包合物适量，按“2.4.3”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得β-细辛醚峰面积的RSD 为0.95%，表明方法重复性良好。

2.4.8 稳定性试验 取同一批包合物适量，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，于制备后放置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得β-细辛醚峰面积的RSD 为0.41%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.9 加样回收率试验 精密称取同一批已知含量的包合物9 份，每份约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分为3组，分别按高、中、低浓度精密加入对照品溶液适量，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，计算得β-细辛醚的平均加样回收率为99.53%，RSD 为0.77%，表明方法准确性较好。

2.5 单因素试验

2.5.1 剪切转速对综合评分的影响 固定剪切时间为8 min，β-环糊精与挥发油的质量比为8∶1，β-环糊精与水的质量比为1∶4，剪切转速分别设置为2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 r/min。以各综合评分（Y）对剪切转速（X）绘图，见图2。可见，随着剪切转速的不断增大，综合评分呈先增大后平稳的趋势。考虑到剪切转速过高，一方面会对剪切机的机械磨损较大，另一方面会使部分包合液溅出，造成一定的物料损失，故剪切转速不宜设定过高。

图2 剪切转速对综合评分的影响Figure 2 Effect of shear speed on the comprehensive score

2.5.2 剪切时间对综合评分的影响 固定剪切转速为3 000 r/min，β-环糊精与挥发油的质量比为8∶1，β-环糊精与水的质量比为1∶4，剪切时间分别设置为1、2、3、5、7 min。以各综合评分（Y）对剪切时间（X）绘图，见图3。可见，随着剪切时间的不断增大，综合评分呈先增大后平稳的趋势；剪切时间在1～2 min时，增加趋势较明显；随着剪切时间延长，包合反应逐渐达到平衡，故综合评分增加趋势逐渐平缓。

图3 剪切时间对综合评分的影响Figure 3 Effect of shearing time on comprehensive score

2.5.3β-环糊精与挥发油的质量比对综合评分的影响 固定剪切转速为3 000 r/min，剪切时间为5 min，β-环糊精与水的质量比为1∶4，β-环糊精与挥发油的质量比分别设置为4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1。以各综合评分（Y）对β-环糊精与挥发油的质量比（X）绘图，见图4。可见，随着β-环糊精用量的不断增大，综合评分呈先迅速增加后略有增加的趋势；当挥发油的加入量恒定时，随着β-环糊精用量的不断增加，β-细辛醚几乎全部进入β-环糊精空腔，因此再增加β-环糊精用量但综合评分仅略有增加。

图4 β-环糊精与挥发油的质量比对综合评分的影响Figure 4 Effect of mass ratio of β-CD and volatile oil on comprehensive score

2.5.4β-环糊精与水的质量比对综合评分的影响 固定剪切转速为3 000 r/min，剪切时间为5 min，β-环糊精与挥发油的质量比为8∶1，β-环糊精与水的质量比分别设置为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10。各综合评分（Y）对β-环糊精与水的质量比（X）绘图，见图5。可见，随着水用量的不断增大，综合评分呈略微下降的趋势。推测随着水用量的不断增大，β-环糊精被逐渐分散在溶液中，β-细辛醚与β-环糊精的碰撞概率减小，故β-细辛醚进入β-环糊精空腔的概率减小，使得综合评分逐渐下降，但下降趋势不明显，基于节能增效等实际生产角度出发，将β-环糊精与水的质量比固定为1∶4。

图5 β-环糊精与水的质量比对综合评分的影响Figure 5 Effect of mass ratio of β-CD and water on compre‐hensive score

2.6 Box-Behnken响应面优化包合工艺

2.6.1 Box-Behnken 试验设计及结果 选取单因素试验考察中影响较大的剪切时间（A）、剪切转速（B）、β-环糊精与挥发油的质量比（C）为影响因素，以包合物得率、β-细辛醚包合率的综合评分作为响应值，采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件设计三因素三水平的响应面试验，因素与水平见表1。基于信息熵赋权原理，按“2.3”项下方法得到包合物得率、β-细辛醚包合率的权重系数分别为0.162 4、0.837 6，并计算综合评分，Box-Behnken 响应面设计及结果见表2。

表1 因素与水平Table 1 Factors and levels

2.6.2 Box-Behnken 试验结果分析 利用Design-Expert.V8.0.6.1 软件对表2中综合评分值进行二次多元回归拟合，结果见表3。由结果可得到对编码自变量A、B、C 的二次多项式拟合回归方程：M=0.860+0.070A+0.16B+0.032C+0.037AB+0.032AC+0.053BC-0.043A2-0.12B2+0.003C2。建立的二次多元模型F=12.78，模型P=0.001 4<0.01，表明该试验拟合的模型差异具有统计学意义。失拟项P=0.749 8>0.05，表明失拟项不显著，未知因素对试验结果干扰小，残差均由随机误差引起。综合评分回归方程的相关系数R2=0.942 6>0.9，表明可用此模型来分析和预测石菖蒲挥发油剪切包合工艺结果。由F值可见，各因素对综合评分影响大小顺序为：剪切转速（B）>剪切时间（A）>β-环糊精与挥发油的质量比（C），因素A、B 及二次项B2对综合评分的影响具有统计学意义（P<0.05），其余项影响不具统计学意义，表明各因素对综合评分的影响并非简单的线性关系。为了直观表达2个因素同时对综合评分的影响，根据回归模型方程，固定任意一个因素的值，考察其他2 个因素交互作用对综合评分的影响，结果见图6-8。可见，交互项AB、AC、BC对综合评分的影响不具统计学意义，表现为3D 响应面较为平缓，这与方差分析结果一致。

图6 剪切转速与剪切时间对综合评分影响的响应曲面和等高线图Figure 6 Response surface and contour plots of the effect of shear speed and shear time on the comprehensive score

表2 Box-Behnken响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken response surface test

表3 拟合回归方程的方差分析结果Table 3 The results of analysis variance of the fitted regression equations

2.6.3 设计空间的建立 在Box-Behnken 设计试验中，建立了剪切时间（A）、剪切转速（B）、β-环糊精与挥发油的质量比（C）3 个关键因素与包合物得率、β-细辛醚包合率的综合评分之间的二项式模型及其拟合回归方程。模型是设计空间的基础，数学模型的准确性与否将直接影响设计空间是否可靠。但经过对比分析发现，模型的预测值与实际值存在一定误差，表明模型的可靠性需要进一步考察[15]。因此，本研究根据Box-Behnken 设计试验建立的模型为基础，选取Box-Behnken 试验中具有显著性影响的剪切时间（A）、剪切转速（B），进行设计空间的开发，采用置信区间来考察设计空间的可靠性。为进一步提升工艺品质，依据企业实际生产情况，设定包合工艺综合评分值应大于0.85。通过Design-Expert.V 8.0.6.1 软件建立设计空间，由于模型的预测值与真实值之间存在一定差异，导致设计空间的边界具有不确定性[16]，故加入置信水平α=0.05 的置信区间，结果采用Overlay polt 可视化，见图9。可见，β-环糊精与挥发油的质量比对综合评分的影响无显著性，故用β-环糊精与挥发油的质量比调节设计空间；当β-环糊精与挥发油的质量比为8∶1时，出现稳健区；当β-环糊精与挥发油的质量比为10∶1时，稳健区达到最大值，然后随着β-环糊精与挥发油的质量比的不断增大稳健区也逐渐减小。优化得到的设计空间具有不规则性，为方便实际操作，在设计空间中选择规则的矩形区域如图9B 中红色框区域所示，得到推荐的操作空间范围：剪切转速为4 400～6 000 r/min，剪切时间为3.5～5.0 min。

图7 剪切时间和β-环糊精与挥发油的质量比对综合评分影响的响应曲面和等高线图Figure 7 Response surface and contour plots of the effect of shear time and mass ratio of β-CD to volatile oil on comprehensive score

图8 剪切转速和β-环糊精与挥发油的质量比对综合评分影响的响应曲面和等高线图Figure 8 Response surface and contour plots of the effect of shear speed and mass ratio of β-CD to volatile oil on comprehensive score

图9 加入95%置信区间的包合工艺设计空间Figure 9 Inclusion process design space with 95% confidence interval

2.7 设计空间的验证试验

综合考虑包合效果及实际生产成本，故从设计空间中选定β-环糊精与挥发油的质量比为8∶1。在设计空间内、外共选取5 个试验点进行验证试验，1号、2 号和3 号为95%置信区间内的点（亮黄色区域），4 号和5 号为原设计空间内即95%置信区间外的点（浅黄色区域），验证结果见表4。从验证结果可知，预测值和实际值相接近，独立样本t检验P=0.921>0.05，表明实测值与预测值差异无统计学意义，模型具有较好的预测性。

表4 验证试验结果Table 4 The results of verification test

2.8 包合物的验证试验

采用KBr 压片法，扫描范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描64 次。分别对石菖蒲挥发油、β-环糊精、石菖蒲挥发油物理混合物、石菖蒲挥发油包合物验证样品红外区间吸收峰的变化进行分析，结果见图10。以验证5（包合物5）为参照图谱，石菖蒲挥发油、物理混合物、验证1～4（包合物1～4）、β-环糊精的相似度分别为0.15、0.53、0.99、0.99、1.00、1.00、0.88，表明所优选的设计空间制备工艺稳定，包合物质量具有一致性。石菖蒲挥发油包合物的红外特征与β-环糊精相似，在波数2 927、1 368、947、861、756、609、578、529 cm-1处均有吸收，且峰形相同，但二者的吸收存在一定差异。包合物在1 639、1 511、1 411、1 333、1 246、1 205 cm-1处有新的吸收，在1 205～1 639 cm-1的红外吸收峰差异较大，原因可能是石菖蒲挥发油进入了β-环糊精的空腔且影响了碳氢的弯曲振动（δC-H）；在2 000 cm-1、654～708 cm-1的指纹区也显现了一定的差异，表明石菖蒲挥发油的进入改变了β-环糊精的化学环境。石菖蒲挥发油与石菖蒲挥发油包合物的红外吸收光谱具有显著差异，经包合后石菖蒲挥发油在1 741、1 672、1 699、1 585、1 608、1 464、1 439 cm-1等处的吸收峰均减小，表明石菖蒲挥发油包合后，其红外振动受到限制。物理混合物的红外光谱图既有3 368、2 927 cm-1等β-环糊精的红外吸收，又有1 511、937、1 205 cm-1等挥发油的红外吸收，为β-环糊精与石菖蒲挥发油的加和。

图10 石菖蒲挥发油包合物的红外光谱图Figure 10 IR spectrogram of volatile oil inclusion complex of A.tatarrinowii Schott

3 讨论

目前，挥发油包合物制备工艺主要有饱和水溶液法、研磨法和超声法，常经过冷藏、抽滤、洗涤、干燥等工序，包合过程速度慢、成本高[17-18]。喷雾干燥通过将包合液雾化成细小的液滴，再采用热空气进行干燥，从而在较短的停留时间内将包合液转化为固体粉末，具有生产效率高、产品特性稳定、全过程自动可控的优点，更适合大规模工业化生产[19-20]。本课题组前期对喷雾干燥工艺进行优化并完成了多次验证试验，结果表明喷雾干燥工艺参数对包合物的质量无显著影响[11]；因此，本研究确定喷雾干燥工艺参数为进风温度175 ℃，出风温度90 ℃，进一步采用响应面法优化石菖蒲挥发油高速剪切包合工艺，为石菖蒲挥发油的固体制剂生产提供依据。

从欢[21]、杨小催[22]、柯瑜[23]等采用饱和水溶液法制备石菖蒲挥发油包合物，搅拌包合时间主要为1～3 h，且常用石油醚、甲醇等对包合物进行洗涤，最后进行3～4 h 的低温干燥，得粉状包合物。本研究采用高速剪切结合喷雾干燥技术制备石菖蒲挥发油包合物，既显著地缩短了包合时间，提高了生产效率；又可减少过滤、洗涤等制备工序，具有操作简便、绿色环保的特点。钱一帆等[9]采用胶体磨包合法制备石菖蒲挥发油包合物，包合时间较短（20～40 min），但清洗操作较为不便，在一定程度上造成包合物的损失和残留。本研究采用高速剪切技术对石菖蒲挥发油进行包合，与王景霞等[24]研究结果对比，其包合物得率及β-细辛醚包合率更高，可分别达90%、50%以上，且包合时间更短，为3.5～5.0 min。

综上，高速剪切包合技术具有包合率高、生产效率高、工艺稳定、操作简便等优点，对工业化放大生产具有一定的参考价值，可进一步推广使用。