贺兰山东麓产区不同地块酿酒葡萄果实类黄酮物质分析

任小彤，彭婧，韩晓，王军，何非

（中国农业大学食品科学与营养工程学院葡萄与葡萄酒研究中心/农业农村部葡萄酒加工重点试验室，北京 100083）

葡萄果实中的酚类物质（Phenolics）主要分布在果皮和种子中，包括类黄酮物质（Flavonoids）和非类黄酮酚类物质（Non-flavonoids）两大类。其中，类黄酮物质的基本结构骨架为C6-C3-C6，包括花色苷（Anthocyanins）、黄酮醇（Flavonols）和黄烷醇（Flavanols）类物质，在植物体内通过苯丙烷-类黄酮代谢合成途径产生。导致酿酒葡萄中的类黄酮物质产生差异的内在因素是葡萄本身的遗传特性；外在因素主要指环境因素[1]和栽培实践，也就是风土。一般来说，广义的风土包括气候、土壤及人为栽培因素等；狭义的风土则主要指前两者，是产区风格最重要的体现。酿酒葡萄产区的光照、热量、地形、降雨和土壤等因素共同构成风土条件[2]。因风土条件不同，同一品种的葡萄果实类黄酮物质的组成和含量在不同地块中也有可能存在差异。

我国新疆玛纳斯、山东蓬莱和云南德钦3个不同产区的‘赤霞珠’果实和葡萄酒中总酚、总类黄酮、总黄烷醇含量不同，并且花色苷种类及含量随海拔升高呈上升的趋势[3]。气温、光照、水分和土壤等都会对类黄酮物质产生影响。日本的相关研究发现，在成熟早期，夜间高温条件下葡萄浆果中花色苷生物合成会受到抑制，这可能是由于花色苷生物合成基因的表达水平较低以及花色苷生物合成酶活性较低所致[4]。研究发现，将浆果进行冷却会导致(-)-表没食子酸儿茶素延伸亚基的比例显著增加[5]。光照对葡萄果实中类黄酮代谢产物的合成积累量和该路径的碳流向有影响，进而使生成的二羟基产物和三羟基产物比例产生差异[6]。光照对黄酮醇的积累会产生影响。在德国盖森海姆葡萄园中的研究发现，黄酮醇合酶和黄酮醇糖基转移酶基因的表达在遮阴果穗中几乎不存在，但在重新光照后表达增加，浆果的黄酮醇含量也增加了很多[7]；另有研究发现，缺水诱导F3'5'H（类黄酮3'5'-羟化酶）基因表达，使得三羟基花色苷含量增高[8]。在澳大利亚南部5个商业葡萄园3年的试验表明，土壤特性是通过对葡萄树的冠层、产量和浆果大小的影响来间接影响浆果的成分[9]。

试验选择在宁夏贺兰山东麓产区两个酒庄的4个地块开展，采集商业采收期的‘霞多丽’和‘赤霞珠’葡萄浆果，对果皮及种子中的类黄酮类物质进行检测，探究在不同风土条件下葡萄浆果中类黄酮类物质的差异以及造成差异的原因，以期为该产区葡萄酒特征风格的塑造和小产区的划分提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及气候、土壤数据的收集

本试验选择的葡萄园位于宁夏贺兰山东麓产区，属于温带大陆性气候，有志辉源石酒庄的志辉地块和仁益源酒庄的华西、金山和高家闸共4个地块，地块和品种信息如表1所示。葡萄树整形方式均为改良VSP树形，即“厂”形，自根苗，南北行向，短枝修剪，留梢量为每株12～15条，留果量为每梢1～2穗。病虫害处理及施肥量均根据当地标准制定，其他均采用常规的田间管理。

表1 不同地块基本信息Table 1 Basic information of different parcels

采集2020年商业采收期的‘霞多丽’和‘赤霞珠’葡萄果实。每个品种在每个地块采集红、黄、蓝3个生物学重复。在园中随机选取3行相邻葡萄植株，每行选择15株树，随机分为红、黄、蓝各5株，3行共选择45株。上午10:00以前采样，采用“五点取样法”。每个生物学重复采集300粒，共900粒。每个重复中100粒浆果用于理化指标检测，剩余样品在液氮中冷冻后置于﹣80 ℃的冰箱中贮存，用于类黄酮类物质检测。

气象数据在中国气象数据网（http://data.cma.cn/）采集。4个地块与气象站的距离分别为：金山：30.1 km；华西：22.5 km；志辉：20 km；高家闸：16.8 km。地理位置如图1所示。

图1 四个地块与气象站地理位置分布Figure 1 Geographical distribution of four parcels and weather station

2020年，在葡萄的生长季（4—9月）内，总降雨量为1835 mm，有效积温为1866.5 ℃，2011—2020年生长季平均有效积温为1887.3 ℃。在6—8月葡萄生长期日最高温度为20～38 ℃，成熟期日均温为15～28 ℃，最适温度在17～24 ℃之间[10]，说明气温适宜葡萄生长，降水也集中在这一时期。

土壤样品在每个地块于采样所在的葡萄种植行间的行前、中、后共选取3个采样点收集，进行土壤相关指标：全氮、全磷、全钾、有机质含量，pH、电导率（EC）、阳离子交换容量（CEC）和颗粒大小的测定。志辉地块的全磷和全钾含量均显著高于其他地块，而金山地块的全磷含量和高家闸地块的全钾含量均显著低于其余地块。4个地块的土壤EC值都在22～40 mS·m-1之间，说明土壤属于非盐碱土，对于有机质和EC来说，各地块之间无显著性差异。所有地块的土壤pH值均在8.4以上，为碱性土。土壤CEC值范围为3.5～8.5 cmol·kg-1，大小为高家闸＞金山＞志辉＞华西，说明高家闸和金山地块的土壤肥力较高。土壤颗粒组成反映土壤砂粘性的程度，与植物生长关系非常密切[12]，4个地块的土壤均属于砂壤土。高家闸的土壤类型更偏向粘土，其次是金山地块，再次是华西地块，志辉的土壤偏向于砂土。

1.2 试剂与仪器

试剂：氢氧化钠、酚酞、甲醇、乙酸钠、间苯三酚、丙酮、抗坏血酸、盐酸等均为分析纯，购于天津化工厂；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）购于美国Sigma-Aldrich公司；D-葡萄糖酸内酯购于上海Sangon Biotech公司；上机检测流动相中的甲醇、甲酸、乙腈均为色谱级，购于美国Sigma-Aldrich公司；花色苷、黄酮醇及黄烷醇标品购于法国中草药（Extrasynthese）公司。

仪器：冷冻干燥机FD-1C-50，北京博医康实验仪器有限公司；TDL-5-A低温离心机产于上海飞鸽仪器有限公司；美国安捷伦1200系列高效液相色谱仪串联Bruker系列离子阱质谱仪，并配有可变波长检测器（VWD），色谱柱为Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；美国安捷伦1200系列高效液相色谱串联三重四级杆（QqQ）质谱仪，色谱柱为美国安捷伦科技有限公司Poroshell 120 EC-C18（150 mm×2.1 mm，2.7 µm）。

1.3 类黄酮类物质的提取与检测

参照陈为凯[13]的方法进行果皮中花色苷和黄酮醇以及果皮和种子中黄烷醇的提取。将上述提取液在检测前采用0.22 μm尼龙滤膜过滤，参照赵培汝[14]的方法进行花色苷的检测。花色苷及其衍生物的定量采用外标法，外标物为二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，花色苷含量均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量计。参照陈为凯[13]的方法进行黄酮醇和黄烷醇的检测，黄酮醇定量采用外标法，以杨梅酮-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷为外标物；各类黄酮醇物质以相应外标物的含量计，西伯利亚落叶松黄酮-3-O-葡萄糖苷使用异鼠李素-3-O-葡萄糖苷为外标物进行定量；黄烷醇定量分别以(+)-儿茶素、(+)-棓儿茶素以及(-)-表棓儿茶素为外标物，计算5种黄烷醇的含量。类黄酮类物质的定性依据为本实验室所建立的葡萄与葡萄酒酚类物质HPLC-UV-MS指纹谱库[15]。

1.4 数据分析

使用Microsoft Excel 2016软件进行标准曲线、平均值和标准偏差的计算；通过SPSS 22.0（IBM，USA）进行单因素方差分析（Duncan，P＜0.05）；采用Simca 14.1进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 不同地块‘霞多丽’果实类黄酮物质分析

在‘霞多丽’葡萄浆果中，两个地块中均检测出12种黄酮醇单体和5种黄烷醇单体。从表2中可知，检测出的黄酮醇类物质为槲皮素类、山奈酚类和异鼠李素类等。两个地块中总黄酮醇含量无显著差异，仅有高家闸地块的异鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量显著高于志辉地块。

表2 不同地块‘霞多丽’葡萄果皮中的黄酮醇Table 2 The concentration of flavonols in 'Chardonnay' grape peels in different parcels mg·kg-1 FW

根据B环羟基取代的不同，F3'H（类黄酮3'-羟化酶）羟基取代黄烷醇有(+)-儿茶素和(-)-表儿茶素，F3'5'H羟基取代黄烷醇有(-)-表棓儿茶素。mDP（Mean Degree of Polymerization，平均聚合度）是黄烷醇类物质的一个重要指标，其计算公式是：mDP＝(延伸单元物质的量＋末端单元物质的量)/末端单元物质的量。

从表3中可以看出，志辉地块的葡萄浆果果皮中的原花色素的(-)-表儿茶素末端单元含量显著高于高家闸地块，而高家闸地块的果皮mDP、果皮原花色素(-)-表棓儿茶素末端单元和(-)-表儿茶素没食子酸酯末端单元含量显著高于志辉地块。

表3 不同地块 ‘霞多丽’葡萄果皮及种子中的黄烷醇Table 3 The concentration of flavanols in 'Chardonnay' grape peels and seeds in different parcels mg·kg-1 FW

2.2 不同地块‘赤霞珠’果实类黄酮物质分析

在‘赤霞珠’葡萄浆果中，共检测到14种花色苷单体、12种黄酮醇单体和5种黄烷醇单体。根据B环羟基取代的不同，花色苷可以被分为两类：F3'H羟基取代花色苷（花青素类和甲基花青素类）和F3'5'H羟基取代花色苷（花翠素类、甲基花翠素类和二甲花翠素类）。二甲花翠素结构中B环不含有邻位羟基，对酶类和金属离子的氧化不敏感，因此具有较强的抗氧化力。类似地，甲基花青素也有较强的抗氧化力[16]。

根据表4可知，华西地块的二甲花翠素-3-O-咖啡酰化花色苷含量显著高于志辉和金山地块；金山地块的甲基花翠素-3-O-香豆酰化花色苷含量显著高于志辉和华西地块。

表4 不同地块‘赤霞珠’葡萄果皮中的花色苷Table 4 The concentration of anthocyanins in 'Cabernet Sauvignon' grape peels in different parcels mg·kg-1 FW

从表5中可知，金山地块的杨梅酮-3-O-葡萄糖醛酸苷含量显著高于华西地块的含量，并且金山地块的槲皮素-3-O-芸香糖苷含量显著高于其余地块的含量；志辉地块的杨梅酮-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷含量显著低于华西和金山地块的含量；华西地块的山奈酚-3-O-葡萄糖苷含量显著高于志辉地块，而华西地块的异鼠李素-3-O-葡萄糖苷和丁香亭类-3-O-葡萄糖苷含量显著高于其余两个地块。

表5 不同地块‘赤霞珠’葡萄果皮中的黄酮醇Table 5 The concentration of flavonols in 'Cabernet Sauvignon' grape peels in different parcels mg·kg-1 FW

由表6可知，延伸单元的含量是果皮和种子中总黄烷醇含量的主要组成部分。对于‘赤霞珠’来说，华西地块的果皮总游离单体和总延伸单元的含量均显著低于其余地块的含量；志辉地块的果皮总末端单元的含量显著低于华西和金山地块。种子的总游离单体、总末端单元、总延伸单元含量和mDP在三个地块之间均无显著性差异。华西地块的果皮黄烷醇总含量显著低于其余两个地块的含量，金山地块的种子黄烷醇总含量显著高于志辉地块的含量。对于黄烷醇总含量和类黄酮总含量来说，均为金山地块的含量显著高于志辉地块的含量。

表6 不同地块 ‘赤霞珠’葡萄果皮及种子中的黄烷醇Table 6 The concentration of flavanols in 'Cabernet Sauvignon' grape peels and seeds in different parcels mg·kg-1 FW

2.3 不同地块两品种果实的特征性差异化合物分析

为了探究‘霞多丽’及‘赤霞珠’浆果中类黄酮类物质的特征差异性化合物，用相应地块的花色苷、黄酮醇和黄烷醇物质为判别指标，进行有监督的正交偏最小二乘判别分析，结果如图2所示。

图2 葡萄果实中类黄酮物质含量的OPLS-DA模型分析Figure 2 The OPLS-DA models analysis based on the flavonoids compounds in grape fruits

采用了OPLS-DA模型进行分析，‘霞多丽’中提取到的前两个主成分解释了总方差的83.5%，说明这两个主成分可以很好地将两个地块分开。从图2A中可以看出，位于X正半轴的是高家闸，而志辉位于X轴的负半轴。结合图2B可以看出，志辉和高家闸地块都有一定种类的黄酮醇和黄烷醇类特征性差异物质。‘赤霞珠’中提取到的前两个主成分解释了总方差的60.6%，能够较好地代表原始数据。从图2C中可以看出，志辉位于X轴正半轴、Y轴负半轴，华西位于X轴的负半轴、Y轴负半轴，而金山位于X轴正半轴、Y轴正半轴，3个地块被较好的分开了。结合图2D可知，志辉地块的主要特征差异性化合物为黄烷醇类，华西地块含有较多的黄酮醇类化合物，而金山地块含有较多的花色苷类物质。通过VIP预测值表，筛选出VIP＞1的特征差异化合物，如表7所示。

表7 通过OPLS-DA模型识别的主要差异化合物Table 7 Primary biomarker compounds identified by the OPLS-DA mode

3 讨论与结论

对近十年的月平均降水量和月平均温度进行分析发现，2020年的数据处于近十年数值波动范围内，说明2020年份具有典型性。志辉、华西、金山和高家闸4个地块都处于贺兰山东麓，但与山体距离不同[17]，金山地块距离贺兰山最近，易受山上冷气流的影响，因此气温相对较低；高家闸地块因距山较远而气温较高，志辉和华西地块的气温居中。

黄酮醇合成发生在葡萄开花前后和浆果成熟期间[18]。白葡萄的黄酮醇含量以槲皮素类为主[19]，异鼠李素类通常作为非常少量的化合物出现[20]，本试验‘霞多丽’的数据与此规律相符。另有研究表明，红色品种的黄酮醇含量以杨梅酮和槲皮素为主，其中欧亚种含量最多的是槲皮素，与本研究结果相一致[21]。尽管‘霞多丽’葡萄中的黄酮醇含量在高家闸地块和志辉地块中并未表现出显著差异，但是高家闸地块有增加槲皮素类和异鼠李素类物质的趋势，而志辉地块有更多的山奈酚类黄酮醇物质。研究显示，黄酮醇中芦丁的含量与土壤中的粘土含量呈正相关[22]，这可能是‘赤霞珠’在粘土含量更高的金山地块有更多的槲皮素-3-O-芸香糖苷的原因。高温可能导致葡萄中的黄酮醇化合物降解[23]，志辉地块的温度高于华西和金山地块，这可能是‘赤霞珠’的黄酮醇总含量在志辉地块显著低于华西和金山地块的原因。另外，黄酮醇浓度与光照参数呈显著正相关[24]，研究发现光照是葡萄浆果黄酮醇合成的必要条件，编码黄酮醇合酶的基因在遮荫果实中表达大大降低[25]，而太阳辐射会增加槲皮素、山奈酚和杨梅酮的浓度[26]。结合土壤数据，金山地块的土壤CEC值较高，而华西地块的较低，因此金山地块的土壤较肥沃、叶片生长较密集，这可能导致果实的遮阴较多，从而接受的光照强度较低，所以‘赤霞珠’在金山地块的黄酮醇类物质浓度较低，而在华西地块浓度较高。

‘赤霞珠’种子中的黄烷-3-醇的含量高于果皮中的，这与已有研究结果一致[21]。结合土壤数据，高家闸地块的土壤全氮和CEC值均显著高于志辉地块，说明其土壤可能更有利于葡萄树体和浆果的生长[27-28]，因此高家闸地块葡萄的叶片生长较密集，遮阴程度较高、光照较少。相反，志辉地块的遮阴程度则较低、光照较多，研究发现，在黑暗条件下，(-)-表儿茶素的含量下降[29]，此外，对于果皮来说，遮阴会减少末端亚基的含量[30]，高家闸地块遮阴较多、光照较少，这可能是‘霞多丽’在该地块的果皮(-)-表儿茶素末端单元浓度低于志辉地块的原因。另外，研究发现，温度降低会导致3'5'-羟化原花色素的比例增加[31-32]，金山地块温度低于华西地块，这可能导致了金山地块‘赤霞珠’的果皮游离(-)-表棓儿茶素浓度较高。土壤中的磷含量与儿茶素含量呈正相关[22]，志辉地块的全磷含量显著高于其余地块，可能促进了‘赤霞珠’在该地块的果皮游离(+)-儿茶素的积累。研究表明，随着热量的积累，末端亚基的积累可能有所减少[33]，高家闸地块的温度较高，这可能是‘霞多丽’在该地块的果皮中总末端单元浓度显著低于志辉地块的原因。另外，热量积累最多的水果也具有最高的原花色素mDP[33]，因此‘霞多丽’在高家闸地块的果皮原花色素mDP高于志辉地块；同理，‘赤霞珠’在志辉地块的果皮原花色素mDP也显著高于华西和金山地块。

在3个地块的‘赤霞珠’中，均为花青素类花色苷含量最少，而二甲花翠素类含量最多，这与已有研究结果一致[23]。花色苷的浓度随着水分的减少而增加，也随着浆果变小而增加[34]。对意大利东北部10年生‘美乐’葡萄的研究发现，受到水分胁迫的葡萄果实在收获时的总花色苷含量连续两年增加[35]。结合土壤分析可知，华西地块的土壤偏向砂土，水分含量较低，加之华西地块的‘赤霞珠’果实的粒质量和粒体积均显著低于金山地块，可能导致了华西地块的二甲花翠素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷浓度较高。有研究发现，高温降低了F3'5'H取代的花色苷浓度，并且甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷会由于高温而减少[32]，此外，在夜间高温下，花青素、花翠素和甲基花翠素类花色苷占总花色苷含量的比例会大大降低[36]。金山地块温度较低，这可能导致了‘赤霞珠’在该地块的甲基花翠素-3-O-香豆酰葡萄糖苷的浓度较高。

总体来说，宁夏贺兰山东麓产区的不同地块对酿酒葡萄果实的类黄酮物质的浓度和组成产生了影响，对于‘霞多丽’葡萄，温度和土壤肥力较低的志辉地块可以赋予果实更多的黄烷醇类物质，而土壤较粘和土壤肥力较高的高家闸地块可以赋予其更多的黄酮醇类物质。对于‘赤霞珠’葡萄，不同地块对黄酮醇和花色苷类物质影响更大，华西地块的‘赤霞珠’中特征性差异化合物以黄酮醇类为主，而金山地块的‘赤霞珠’则含有更多的花色苷类化合物。