骨髓间充质干细胞治疗骨科疾病研究进展

梁朝鑫,周安远,王 伟,周 游,戈 超,高莉鹏, 李兴勇,张 琨,雷 云,杨 渊

(1．广西中医药大学，广西 南宁530200；2．广西医科大学，广西 南宁530021； 3．广西骨伤医院，广西 南宁530012；4．广西医大开元埌东医院，广西 南宁530028)

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种具有良好的多向分化和自我更新能力的多能干细胞。在1976年Friedenstein等[1]首次从骨髓中提取出BMSCs。由于其具有取材方便且易于分离培养、扩增等特点，使其在骨与软组织治疗方面起到了日益广泛的作用。近年来，有关BMSCs的研究得到了扩展，特别在治疗骨科疾病方面中的应用越来越广泛，由于其发挥的临床效果显著，目前已用于多种骨科疾病的替代疗法。本文结合近年国内外BMSCs的相关临床研究，就BMSCs的分离与鉴定、生物特性，及其对骨缺损、股骨头坏死、骨关节炎、脊髓损伤、修复关节软骨和椎间盘等方面的研究进展进行综述，旨在为临床治疗骨科疾病提供参考。

1 BMSCs的分离方法与鉴定

目前，对于BMSCs体外分离培养的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠法、组织消化法等，每种方法都存在各自的优劣。迄今为止，常用的方法是密度梯度离心法[2]。密度梯度离心法是依据颗粒的不同密度和直径引起的沉降速度的不同，在离心作用下各颗粒以一定的速度沉降，进而在不同的密度梯度区域上形成区带的原理，分离出不同密度的细胞[3]。有研究显示，密度梯度离心法能够有效分离出BMSCs，并发现密度在1.067～1.070 g/ml之间的介质分离出的骨髓间充质干细胞明显增多，因此在使用不同密度的介质进行分离具有重要意义[4]。此方法具有操作简便、耗费低廉等的优势，可在选择合适的密度介质后进行分离更容易获得较高纯度BMSCs。

由于BMSCs缺乏特异性表面标志物，目前对于BMSCs的鉴定方法尚未得到统一，最常用的方法是使用流式细胞术对其进行鉴定。流式细胞术鉴定发现BMSCs对CD44、CD73、CD90表面标志物表达阳性，且阳性率均达到90%以上，而造血干细胞表面标志物CD34、CD45表达阴性[5]。流式细胞术具有灵敏度高、精度高、多参数等特点，因此应用在BMSCs鉴定方面得到了进一步推广。

2 BMSCs的生物学特性

BMSCs可在自身中提取，取材方便且来源充足，由于其具有多向分化和自我增殖的特点，大量研究证明BMSCs有向成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等方向分化的潜能。骨科疾病的治疗中，BMSCs发挥出了自身的特性，给在临床上骨与软组织的修复带来更佳的治疗方式。BMSCs在骨与组织修复中的主要特性：①BMSCs具有强大的增殖能力和多向分化的特性：在适宜的体内或体外环境下，BMSCs有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞等多种细胞分化的能力[6-7]。②BMSCs具有分泌多种内分泌因子的潜能：产生的内分泌因子参与到组织中的增殖、凋亡、免疫调节和血管生成等过程中，促进损伤区域的恢复，引起免疫系统的反应，从而起到保护其他细胞免于凋亡的作用[8]。

3 BMSCs在治疗骨科疾病的应用

随着近年来许多研究显示出BMSCs的治疗优势，结合其独特的生物学特性，越来越多的研究者将其运用到治疗骨科疾病过程中。在基础和临床研究中运用BMSCs治疗骨缺损、股骨头坏死、骨关节炎、脊髓损伤及修复关节软骨和椎间盘等方面获得了广泛重视，并广泛运用在各种组织修复和再生医学的临床决策中。对此，国内外对使用BMSCs治疗骨与软组织损伤做了大量的研究。

3.1 治疗骨缺损 由骨折或骨肿瘤切除等因素引起的骨缺损一直是创伤骨科面临的重大难题，常使用自体骨移植或骨搬运术的方式治疗。因为植骨术可用的骨量有限，而骨搬运术又需要很长的时间来治疗，因此需要利用BMSCs分化为成骨细胞的能力，以达到治疗骨缺损的目的[9]。研究显示，BMSCs可以成功诱导新骨的形成，并且具有良好的安全性[10]。一项研究发现共同培养的BMSCs和内皮祖细胞不仅加速骨缺损的修复，还促进了支架上血管和骨骼的形成[11]。BMSCs可能显著提高了骨诱导支架的骨再生能力[12]。Lawrence等[13]通过研究分析了各种支架材料的细胞整合、活力和获得的BMSCs的分化能力对治疗骨缺损疗效，发现BMSCs对头部组织和骨科再生医学领域产生积极影响。Dina等在36只双下肢胫骨缺损的大鼠中，各在左胫骨缺损接受富含血小板的纤维蛋白(PRF)，右胫骨接受加载在壳聚糖支架上的BMSCs，结果显示BMSCs和PRF虽都能有效治愈大鼠胫骨模型中诱导的骨缺损，但BMSCs的愈合效果更佳，在所有时间点都表现出比PRF更高的平均钙和磷重量百分比。一项随机对照实验将丝素蛋白/壳聚糖/纳米羟基磷灰石(SF/CS/nHA)和BMSCs三维支架修复兔长节段性骨缺损，发现载有BMSCs的SF/CS/nHA支架在修复桡骨节段性缺损取得很好的治疗效果，均优于其他治疗组[14]。虽然拥有大量将BMSCs运用在治疗骨缺损的基础研究，并且大多取得良好的疗效，但在临床上运用BMSCs治疗骨缺损的研究数量和研究样本量仍需要进一步扩大，以更好的证实BMSCs的治疗机制。

3.2 治疗股骨头坏死 股骨头坏死是一种发病机制不明确、病因复杂的进行性疾病，常导致髋部疼痛和功能障碍，其发病的原因可分为创伤性与非创伤性，创伤性股骨头坏死一般由于外力作用使传送营养到股骨头的血管遭到破坏，非创伤性股骨头坏死常见大量使用激素或长期饮酒导致血液循环受阻而发病。一项将BMSCs和内皮祖细胞联合移植治疗类固醇诱导的兔股骨头坏死的研究中显示，3D支架中联合移植BMSCs和内皮祖细胞促进了成骨和血管生成同时减少脂肪生成，达到修复股骨头坏死的效果[15]。Mardones等[16]通过核心减压和植入BMSCs治疗股骨头坏死，随访19～54个月后，发现所有患者的疼痛强度均明显减轻，且髋关节功能得到明显改善。一项临床随机对照研究，将100例患者随机分配为BMSCs治疗或核心减压治疗,术后60个月，53例接受BMSCs治疗的髋关节中只有2例病情加重并接受血管化骨移植，而核心减压治疗除去失访的7例患者，在治疗的44个髋关节中出现了10个髋关节病情加重，后期均行血管化植骨或全髋关节置换术治疗，证实了BMSCs在治疗股骨头坏死方面有效地延迟或避免了进行髋关节置换[17]。一项纳入了14项研究，涉及540例患者的荟萃分析显示，髓芯减压联合自体BMSCs具有更好的镇痛作用和临床疗效，并可更有效地延缓股骨头塌陷[18]。通过既往大量的基础和临床试验使用BMSCs运用在治疗股骨头坏死的研究，又随着近些年临床治疗数量的不断增加和临床上的可靠疗效，值得相信BMSCs是治疗股骨头坏死的有效方法。但其在临床的应用也面临着诸多挑战，如患者的选择、标准化程序、安全性评估以及移植细胞的生长情况等[19]。所以未来仍需做进一步探索，寻找解决最适宜的移植方法、移植细胞数和细胞来源等问题，从而更好地在临床上应用BMSCs治疗股骨头坏死。

3.3 治疗骨关节炎 骨关节炎是一种随着年龄的增长，患病率随之增长的退行性疾病，可由创伤、遗传、发育等因素诱发。研究[20]表明，关节内注射BMSCs明显改善了患者的疼痛、功能和生活质量，可有效治疗膝骨关节炎。一项临床随机对照研究，将30例膝骨性关节炎患者随机分配，对照组予以关节内注射透明质酸，两个治疗组分别予以透明质酸与10×106或100×106培养的自体BMSCs,通过随访12个月发现使用BMSCs的治疗组在VAS和WOMAC评分均优于对照组，验证了关节内注射BMSCs是改善膝骨关节炎功能安全可行的方法[21]。Chahal等[22]发现BMSCs在治疗膝骨关节炎同时可减少滑膜炎和软骨退化的发生。虽然有诸多的研究支持BMSCs在治疗膝骨关节炎的有效性，但对于注射的最佳方式与位置仍存在疑虑。对此，Hernigou等[23]将60例双侧膝骨关节炎患者予以左右膝分别在软骨下骨或关节内注射BMSCs，通过两年的随访发现对于软骨下骨治疗组的60个膝关节中有12(20%)例接受了关节置换术，而关节内治疗组的60个膝关节中有42(70%)例选择了关节置换术，表明了在膝关节软骨下骨植入BMSCs的疗效更好，且更有效地推迟关节置换术的发生。当前，BMSCs治疗骨关节炎的研究，已从基础实验慢慢向临床研究过渡，值得肯定的是其在治疗膝骨关节炎发挥了良好的疗效，但对于临床上骨关节炎分期的治疗、治疗效果的持久性和不同体质的适应性等问题仍需进一步研究和思考。

3.4 治疗脊髓损伤 脊髓损伤是一种发病率高、致死致残率高的疾病。它可由挫伤、割伤、压迫或直接的暴力破坏等创伤因素引起的，并且破坏了神经元通路[24]。目前，急性脊髓损伤的治疗方式主要有药物治疗和手术减压，随着对BMSCs研究不断深入，用于治疗脊髓损伤的研究也日益增加。一项采用左T9脊髓半切术建立大鼠脊髓损伤模型的研究显示，BMSCs与碱性成纤维细胞生长因子联合移植可有效修复大鼠脊髓损伤[25]。Wang等[26]发现BMSCs可能通过调节抗氧化信号通路，进而过表达的miR-200a或si-Keap1的促进了大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复，同时降低丙二醛(MDA)水平，增加超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和核因子E-2-相关因子2(Nrf2)表达及其下游血红素加氧酶1(HO-1)、NADPH醌氧化还原酶(NQO1)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)蛋白表达。研究[27]发现，BMSCs衍生的外泌体可通过激活自噬，减弱神经元凋亡，促进脊髓损伤的大鼠功能行为的恢复。Mo等[28]采用Allen冲击器建立T10脊髓损伤模型中，实验组和对照组分别在蛛网膜下腔以注射方式给予BMSCs和PBS，结果显示实验组Nestin和NeuN表达明显升高，GFAP表达明显降低，实验组的神经营养因子水平高于对照组，表明了BMSCs可通过调节移植的细胞因子，提高神经细胞的存活和再生能力，并促进神经功能的恢复。对此，BMSCs促进脊髓损伤功能恢复的作用机制可能与其的神经营养、免疫抑制、代替功能和促进轴突再生有关[29]。因此认为BMSCs可改善脊髓损伤症状，促进神经功能的恢复。

3.5 修复关节软骨与椎间盘 关节软骨的损伤可导致关节疼痛、畸形和功能障碍，由于软骨缺乏神经和血管，所以当软骨损伤时自身的自愈能力非常有限。刘军政等[30]发现高表达的miR-193b、miR-34a、miR-30a、miR-130b、miR-152、miR-99a、miR-90a和低表达的miR-424、miR-135共同参与了大鼠BMSCs软骨分化的调节过程。而人体中的miRNA比大鼠要复杂，且相互之间也有相互调节的能力。研究[31]发现，BMSCs在体内植入时具有形成骨和软骨组织的能力。Araki等[32]在18只猕猴的36个膝关节中造模成膝关节全层骨软骨缺损，随机分为不予药物的干预空白组、仅植入胶原凝胶的凝胶组和植入含有BMSCs 的胶原凝胶的BMSCs组，24周后结果显示，凝胶组虽显示出大部分富含软骨的修复组织覆盖缺损，而BMSCs组尽管产生的新软骨量较少，但软骨表面规则且质量更好，与邻近的软骨无缝整合，并重建了软骨下骨。一项使用源于BMSCs的三维无支架自体构建体植入兔膝关节的骨软骨缺损处的研究，在1年内实现了骨和软骨同步再生，同时证明了此方法具有修复骨和软骨缺损的潜力[33]。由于BMCSs移植在修复关节软骨缺损方面的有用性已在基础研究的猴和兔的模型中得到证实，对此在临床上也做了这方面的研究。在一项临床研究[34]中通过同种异体的BMSCs与自体软骨细胞的组合，以刺激组织的再生，并显著改善了患者膝关节症状和软骨缺损的状态。Yong等[35]在一项含有80例接受软骨修复手术和伴随高位胫骨截骨术的患者的临床研究中，比较了单独植入BMSCs的MSC组和与同种异体软骨一起植入BMSCs的MSC-AC组的效果，通过MSC组平均27.3个月和MSC-AC组平均27.8个月的最终随访显示MSC-AC组在软骨再生方面优于MSC 组，并具有更好的临床效果。因此，对于BMSCs在修复软骨方面的应用，可认为配合BMSCs的植入可能会取得更佳的疗效。

椎间盘退变是一种常见的疾病。研究[36]发现，将自体BMSCs注射到髓核区具有可行性和安全性，并明显缓解了疼痛和改善生活质量。BMSCs可以通过激活AKT和ERK信号来减弱内质网应激，且防止髓核细胞死亡并改善了椎间盘退变[37]。Pettine等[38]通过分析了大约1mlBMSCs的总有核细胞(TNC)含量、集落形成单位-成纤维细胞(CFU-F)频率、分化潜能和表型特征发现虽然通过BMSCs治疗后患者的症状均得到了不同程度的缓解，但接受超过2000 CFU-F/ml的患者的残疾指数(ODI)和视觉模拟量表(VAS)降低速度更快，幅度更大。相对于自体BMSCs注射治疗，Noriega等[39]将24 例诊断为腰椎间盘退变且对保守治疗效果不佳的慢性背痛患者随机分为两组，实验组在局麻下通过椎间盘内注射同种异体BMSCs，而对照组接受麻醉剂对椎旁肌肉组织的假浸润，实验组在BMSCs移植后3个月，VAS和ODI均显著减轻，并在6个月和12个月时保持改善，且在所有时间点均优于对照组，进以证明了同种异体BMSCs可能是治疗退行性椎间盘疾病的有效替代方法，并且比自体BMSCs治疗更方便，具有可行性与安全性。不管是自体BMSCs还是同种异体BMSCs，在修复椎间盘退变中均显示出积极的作用，可减轻患者的疼痛、降低残疾率。

4 结 语

综上所述，目前BMSCs在骨科领域的研究越来越受重视，但在临床方面的应用仍相对较少。由于BMSCs获取方便且安全性高，其具有的多向分化和分泌内分泌因子的潜能，使其在治疗骨科疾病中取得显著的疗效，这为骨科医生提供了一个良好的治疗方案。但其在骨缺损、股骨头坏死等方面的作用机制尚未明确，对移植的细胞数量和细胞来源的不同、载体的选择等问题导致疗效的不确定性仍未解决。虽然在基础实验中拥有大量的研究表明BMSCs对骨与软组织损伤治疗中发挥可靠的作用，但还需要在大型动物模型和临床中进一步研究也需要更长的随访时间，对BMSCs的治疗进行评估和优化以确定其的作用机制。随着再生医学的不断发展，我们可以相信BMSCs未来能够在骨与软组织损伤疾病为人们提供更多的选择和帮助，推动骨与软组织损伤治疗水平的发展。