高效液相色谱法和酶放大免疫法检测伏立康唑血药浓度相关性分析*

李俊明，卓思珺，陈仕鹏，刘成裕，谢瑞杰

（广西壮族自治区柳州市人民医院药学部，广西 柳州 545006）

伏立康唑（VRC）为三唑类抗真菌药，抗菌活性强、抗菌谱广，临床应用广泛［1-2］。VRC在体内呈非线性代谢、个体差异大，剂量与血药浓度相关性不稳定，应针对患者具体情况并结合血药浓度结果制订个体化用药方案，最大限度发挥疗效、减少药品不良反应［3-5］。高效液相色谱（HPLC）法为检测VRC血药浓度的常用方法［6］，而近年酶放大免疫（EMIT）法也逐步用于血药浓度检测［7-8］。为探讨这两种检测方法对VRC血药浓度的影响，本研究中收集VRC达稳态血药浓度的真菌感染患者血液样本59份，分别使用两种方法进行测定，分析测定结果的相关性，并对我院两种检测方法结果进行比较分析，以便临床正确解读检测数据，调整用药方案。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：年龄2～90岁；采血时VRC已达稳态浓度（即负荷给药24 h后或常规给药6 d后）。

排除标准：标本量＜4 mL；标本溶血。

样本收集：收集医院2019年至2020年住院和门诊患者常规VRC检测样本2 045份，2019年收集1 054份，其中59份采用2种方法平行检测，其余均采用HPLC法检测；2020年收集991份，均采用EMIT法检测。

1.2 血药浓度检测方法

1.2.1 HPLC法

色谱条件：色谱柱为Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为25 mmol/L KH2PO4缓冲液-甲醇-乙腈（55∶15∶30，V/V/V）；流速为1.0 mL/min；检测波长为256 nm；柱温为35℃；进样量为10 μL。

样本处理及内标选择：采用10 % HClO4溶液沉淀蛋白法前处理血清样本，以硝西泮作内标。

方法学考察：按相关规定进行精密度、稳定性、重复性试验考察。结果表明，仪器精密度良好，供试品溶液在室温下放置12 h内基本稳定，方法重复性良好。

1.2.2 EMIT法

按照Viva-E型全自动生化分析仪（西门子医学诊断产品有限公司，定量范围为0.5～16.0 μg/mL）的操作规范。取血液样本，5 000 r/min离心5 min，取上清液，采用EMIT VRC测定试剂检测。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0及MedCalc 19.0.4统计学软件分析。组间差异采用双侧配对t检验、配对Wilcoxon检验、Passing-Bablok法和Bland-Altman法分析，并对测定结果进行一致性评价。

2 结果

2.1 VRC血药浓度检测结果相关性分析

结果见表1。计算可知，两种检测方法测得的VRC血药浓度结果具有高度相关性（r=0.879，P＜0.05）。

表1 HPLC法及EMIT法VRC血药浓度检测结果（μg/mL，n=59）Tab.1 Results of serum drug concentration determined by HPLC and EMIT（μg/mL，n=59）

2.2 检测模型建立及相关性分析

59份样本的配对样本t检验分析显示，两种检测方法结果间存在显著差异。以EMIT法血药浓度（CEMIT）测定结果（Y，μg/mL）为纵坐标，HPLC法血药浓度（CHPLC）测定结果（X，μg/mL）为横坐标，建立回归方程Y=0.054 7+1.743X（n=59），Spearman相关系数为0.923（图1 A）；配对Wilcoxon测试分析结果显示，两种方法结果间存在显著差异。分别以两种检测方法结果的差值（CHPLC-CEMIT）和均值（CHPLC&EMIT）为纵坐标和横坐标，以95%的置信区间设定血药浓度的上下限，绘制Bland-Altman偏差图（图1 B）。结果显示，CEMIT为（5.432 2±3.487 98）μg/mL，高 于HPLC法 的（3.283 1±2.052 87）μg/mL，差值的均数（d）值的94.9%（56/59）在95%置信度内。可见，Wilcoxon检验和Bland-Altman分析结果均显示两种检测方法的一致性差。

图1 同一质量浓度下两种检测方法血药浓度结果分析A.Linear regression chart B.Bland-Altman deviation plotFig.1 Serum drug concentration determined by two methods at the same mass concentration

2.3 不同质量浓度范围的两种检测方法相关性分析

HPLC法 检 测VRC有 效 谷 浓 度（Cmin）范 围 为1.0～5.5 μg/mL［3，7-8］。按3个质量浓度范围，将59份样本分为A组（＜1.0 μg/mL，6份）、B组（1.0～5.5 μg/mL，40份）和C组（＞5.5 μg/mL，13份），并采用Wilcoxon检 验，Passing-Bablok回 归 和Bland-Altman分 析。A组、B组、C组 的 回 归 方 程 分 别 为Y1=-5.110+7.385X1（n=6），Y2=-0.012 4+1.853X2（n=40），Y3=-38.494+7.584X3（n=13），Spearman相关系数分别为0.771，0.878，0.505。结果表明，A组和B组两种检测方法相关性较好，而C组相关性较差。Wilcoxon检验结果显示，两种检测方法结果在3个质量浓度范围内均有显著差异；Bland-Altman分析结果表明，CEMIT分别比CHPLC高0.27，2.03，3.39 μg/mL，表明3个质量浓度范围的一致性差。详见图2。

图2 不同质量浓度下两种检测方法血药浓度结果分析A1，B1.Mass concentration＜1.0 μg/mL A2，B2.Mass concentration of 1.0-5.5 μg/mL A3，B3.Mass concentration＞5.5 μg/mL A.Passing-Bablok regression analysis chart B.Bland-Altman deviation plotFig.2 Serum drug concentration determined by two methods under different mass concentrations

2.4 我院患者VRC血药浓度检测结果

2 045份样本主要来源于重症医学科、血液科、呼吸科（2019年占92.98%，2020年占92.23%），患者年龄和血药浓度均符合正态分布。血药浓度，HPLC法测定结果C为（2.67±1.88）μg/mL，最大血药浓度为11.76 μg/mL；EMIT法测定结果C为（4.18±2.69）μg/mL，有3例超过峰浓度（16.0 μg/mL）。详见表2。

表2 我院患者VRC血药浓度测定结果（n=2 045）Tab.2 Determination results of VRC serum concentration in patients in our hospital（n=2 045）

3 讨论

HPLC法被临床广泛用于测定各种药物的血药浓度［9-10］，具有灵敏度高、专属性强的优点。但HPLC法测定前需对样本进行前处理，等待时间长且测定过程复杂，不适用于大样本量分析测定［11］。EMIT法属酶免疫分析技术，其检测基于样本中的药物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）标记的药物竞争抗体结合位点，与抗体结合后，酶活性发生改变，根据酶活性来确定样本中待测药物的浓度［12］。EMIT法所需样本体积较小，一直是临床用于确定内源性和外源性物质的工具，具有自动化程度高，样本处理简单、快速的优点，适用于急诊和大样本量分析测定。但EMIT法是利用抗原-抗体相互识别并结合来产生检测信号，与待测药物具有相同的抗原表面标志（如代谢物、内源性物质等）或抗体有多个抗原结合位点时，会干扰检测结果；同时，样本质量、环境温度等因素也显著影响检测结果。因而其灵敏度和准确性相对较低。EMIT法测定人血浆中VRC浓度时，可能无法区分药物与VRC类似物或代谢产物，导致产生的值更高影响结果［13-14］。

目前，关于VRC目标血药浓度和用药方案调整推荐的研究中多数是基于HPLC法的检测结果。丁记者等［14］及阚智慧［15］对样本进行对比研究，均发现两种检测方法具有明显的相关性和一致性，LI等［13］对比了419例儿童样本的测定结果，发现两种检测方法存在明显相关性，但EMIT法测定结果显著高于HPLC法。本研究结果显示，两种检测方法存在较好的相关性，但总体上EMIT法与HPLC法测定结果有显著差异。在0～5.5 μg/mL范围内两种检测方法具有很好的相关性。Wilcoxon测试和Bland-Altman分析表明在3个质量浓度范围，EMIT法结果均较HPLC法高，并存在显著差异。

因本研究中平行对比的样本量偏小，故对我院HPLC法（1 054例）和EMIT法（991例）的测定结果进行回顾性分析以作为补充。结果表明，在样本主要来源科室分布相近、年龄和血药浓度均符合正态分布的情况下，EMIT法较HPLC法测定结果普遍偏高。

上述研究之所以出现不同的结论，可能与样本来源有一定关系，已建立的HPLC法线性范围较窄，样本测定结果较集中，均与治疗窗浓度1.0～5.5 μg/mL接近［15］。丁记者等［14］的研究对象为口服VRC患者，可能病情和所使用药物种类相对简单，而LI等［13］的研究样本主要为儿童，其中大多数接受了造血干细胞移植，同时使用了多种药物造成干扰。本研究中患者主要来源于重症监护室，病情和用药情况复杂，测定结果分布范围宽。另外，造成结论不一与样本量也有一定关系，本研究样本量偏小，回顾性数据欠严谨。因此，关于两种检测方法的相关性和一致性需更大样本量、更进一步的深入研究。

综上所述，EMIT法和HPLC法检测VRC血药浓度时，结果总体相关性良好，鉴于EMIT法存在测定结果偏高的可能，建议在临床检测时，尤其是对于病情复杂、用药品种多的患者，应予以关注并作相应调整，同一患者多次检测应使用同一种方法，以便为临床提供更准确可靠的个体化用药依据。