外泌体研究的方法学进展

江晗，谢新晖，荣晗(通信作者)

(1.济宁医学院精神卫生学院，山东 济宁 272067；2.深圳市精神卫生中心/深圳市康宁医院，广东 深圳 518020；3.武汉大学人民医院精神科，湖北 武汉 430060)

0 引言

1 样本的收集和处理

外泌体(Extracellular Vesicles，EV) 是胞内多泡体与质膜融合后，释放到细胞外的纳米级小囊泡，粒径在30-150nm、具有脂质双分子层结构[1]。EV 在机体内广泛存在，包裹并运输脂质、蛋白质、核酸及代谢物等，参与细胞间通讯、物质传递和免疫互作[2]。正是由于这些原因，外泌体被广泛研究用于多种疾病的诊断和治疗[3]。在此，我们将从以下几个方面讨论目前关于EV 的研究方法。我们将重点关注外周血中的EV，因为血液易于获取、可常规分离且是与人体多种疾病最相关的体液。

1.1 血液采集

实验室的常规血液采集可应用于EV 研究。对于采集血液的受试者，年龄、昼夜节律周期和性别等变量有待研究，但在实践可行的情况下，一般要求选取隔夜空腹血[4]。血浆通常是首选来源，因为在制备血清时，形成血凝块期间会释放额外的EV[5]。要制备血浆，血液需要抗凝。在选择抗凝血剂时，应考虑离体采集的血液样本中EV 释放的抑制程度和预期的下游分析。目前有多种抗凝剂可供选择，如EDTA、氟化钠、草酸钾、柠檬酸盐等。其中，柠檬酸盐(最终浓度为 0.109 mol/L)是最常用的抗凝剂，已被国际血栓与止血学会推荐[6]。

1.2 血浆制备

为了获得血浆，需要对抗凝血液进行离心处理，以去除红细胞、白细胞和血小板[7]。由于单次离心步骤后仍有少量血小板存在，血小板在激活时会释放EV，并且在冷冻-解冻循环中碎裂，因此建议进行两次离心制备无血小板血浆(PFP)[8,9]。

1.3 培养基

从条件化细胞培养基中也可以分离EVs。如果细胞不能在无血清培养基中生长，专用生物反应器可能是一种替代解决方案[10,11]。

1.4 存储

为了防止冰晶的形成和减少低温沉淀，将血浆样本在液氮中速冻，在80℃或低于80℃的温度下储存，并在37℃下解冻[12]。在冷冻-解冻循环和储存期间，血浆中的EV 被证明似乎是稳定的[8]。

2 外泌体的分离

血液是最常研究的体液，也是最复杂的体液，不仅含有EV，还含有细胞、蛋白质、脂质和核酸[13]。要从血液中研究EV，通常需要先分离EV。不同的生物物理和生物化学特性可用于分离 EV，包括大小、密度、形状、电荷和抗原暴露等。

2.1 差速离心

差速离心法(DC)是根据颗粒大小和密度，通过依次增加离心速度(颗粒细胞和碎片<1500g、稍 大EV 为10 000-20 000g、较 小EV 为100 000-200 000g)的方法来分离外泌体[14]。尽管DC 应用广泛，但它仍有很大的局限性。首先，DC 无法单独通过大小实现EV 的绝对分离，因为EV 沉降速率取决于相对于介质的形状和质量密度[14]。其次，DC 可能导致EV 聚集[15]，并且非EV 组分如蛋白质聚集物等可能会在最后的超速离心过程中破坏EV[16]。最后，DC 报告的EV 回收率在2%至80%之间，这使得研究间的可比性值得怀疑。

2.2 密度梯度离心

密度梯度离心法(DEG) 的原理是根据大小和质量密度(自上而下梯度)，或仅取决于质量密度(自下而上梯度)。碘克沙醇是最常用的用于分离EV 的密度介质，因其具有等渗性、惰性、无毒且粘性较小[17]。通常，DGC 制备的 EV 不含蛋白质污染物，但其产量较低，EV 回收率仅有10%至50%，且费力、耗时，这妨碍了其在临床环境中的使用。

2.3 尺寸排阻色谱法

尺寸排阻色谱法(SEC)在单个色谱柱上实现了基于物质大小的分离[18]。SEC 可去除 99%的可溶性血浆蛋白和大于95%的高密度脂蛋白(HDL)，不诱导EV 的聚集，并保持EV 的完整性和生物活性[19-21]。通过使用SEC，可获得40% 至90% 的EV 回收率[22]。此外，SEC 速度快，每份样品只需10 至20min，且相对便宜[23]，这使得 SEC 在临床上比较适用。

2.4 超滤

超滤可将EV 与可溶性成分分离。要使可溶性组分通过过滤器，需施加压力，或将过滤器置于(超)离心机中。由于所施加的外力，大于孔径的可变形颗粒( 如EVs) 会通过过滤器。超滤比DC 更省时，浓缩100mL 样本需要约20min，而DC需要3-9h[24]。超滤的回收率可达80%，EV 浓缩倍数可达240 倍。这意味着基于超滤的方法对浓缩EV 是有效的。

2.5 免疫捕获实验

大多数免疫捕获试验使用固定在表面(例如板珠或芯片)上的单克隆抗体来捕获暴露于特定配体的EV。基于此类配体(通常为蛋白质)的存在，免疫捕获可以分离EV 亚群[25]，因此在临床上适用。

3 外泌体的检测

对EV 检测方法的选择首先需要了解EV 的物理特性。PFP 含有球形EV(>95%；直径50 nm 至1μm)、管状EV(<5%，直径1μm 至5μm) 和膜碎片(<0.5%，直径1μm 至8μm)[26]。约50% 的EV小于400 nm，且>200 nm 的EV 其浓度随着直径的增加而降低[26,27]。报告的EV 浓度范围为104 至1012EV/mL 血浆，但由于缺乏敏感性和特异性较高的方法，此数值存在误差[26]。对于健康个体，EV生理浓度可能在107至109EV/ mL 血浆[28]，与血小板或红细胞的浓度相当，但低于血液中脂蛋白的浓度[29]。EV 的物理特性阐明了对于EV 检测方法的要求，即理想的方法应检测50 nm 及以上的EV，对每种已知特性有检测极限，有已知的样本体积以测定EV 浓度，并能够测定每种EV 的免疫表型[26,27]。

3.1 电子显微镜

电子显微镜(EM) 是EV 成像的金标准方法。透射电镜的图像分辨率约为1 至3 nm，扫描电镜的图像分辨率约为5 nm。在此，我们将重点介绍透射电子显微镜，它涵盖了对EV 的大多数研究。

根据所研究样本的类型，可采用多种制备方法对EV 进行成像。细胞或组织通常是固定包埋在树脂中，然后切成薄片(约100 nm)，并在观察前进行染色。通过这种经典方法发现了存在于多囊体中并由细胞分泌的EV[30]。为了改善EV 超微结构的保存，可采用高压冷冻、低温树脂包埋和冷冻切片的方法。像血浆或细胞培养上清液这样的亚细胞制备物足够薄，可以直接沉积到EM 网格上。上镜后可以观察到这些样本在负染色后干燥，或者在冷冻液体薄膜中水合。为了对EV 进行免疫表型分析，可将含EV 的样本与胶体金颗粒一起孵育。这些金颗粒的直径通常为4 nm 至40 nm，并与配体(如针对膜蛋白或脂质的抗体)连接。这种被称为免疫金标记的方法可以应用于所有类型的EM方法。尽管EM 成像在EV 研究中具有重要作用[31]，但EV-EM 方案尚未实现标准化。

3.2 流式细胞术

流式细胞术(FC)是分析生物流体中EV 的有力方法，尽管这一潜力尚未完全实现[32]。在FC 中，粒子一个接一个地通过激光束，从而通过光的散射向多个测量点发射荧光信号。采用基于光散射的检测技术进行EV 检测一直是众多研究的主题[33]。在一些广泛使用的FC 仪器上，与基于光散射的检测相比，使用特定的荧光配体，例如膜联蛋白V、抗体或膜染料，可以检测到更多的EV[34]。免疫表型分型的合理方法是使用荧光标记抗体测量表面抗原的存在。然而，尽管细胞可暴露于>1000 个被荧光标记的表面抗原，但EV 通常暴露于<100 个表面抗原，这意味着可检测目标抗原的数量等于或低于大多数流式细胞仪的检测极限[32]。

通过FC 进行的EV 分析易受群体伪影的影响，其中一种是由激光束中同时存在的多个EV 引起的[35]，因此需要进行连续稀释的对照实验。其他混杂因素还包括非EV 成分的存在，如抗体聚集体、无机沉淀物、脂蛋白等[4,36]。尽管FC 的原理非常适合于对EV 进行检测、列举和表型分析，但要在生物流体中对EV 进行全面表型分析，还需提高仪器灵敏度。

3.3 纳米颗粒跟踪分析

纳米颗粒跟踪分析(NTA)通过用暗场显微镜跟踪纳米颗粒的布朗运动来确定悬浮颗粒的大小和浓度。NTA 无法区分EV 和非EV 粒子。对于多分散样本，包括大多数含EV 的生物流体，通过NTA 测定大小优于动态光散射技术[27]，同时因为检测体积不是已知的，所以只能估计粒子的浓度。其他可测量EV 特性的方法有电泳迁移率、荧光和折射率。然而，这些选项在EV 的应用上仍处于开发的早期阶段[37]。

3.4 电阻脉冲传感

电阻脉冲传感(RPS) 通过使用库尔特原理(Coulter)测定悬浮液中纳米颗粒的大小和浓度，其中每种颗粒都通过一个孔进行检测[38]。RPS 无法区分EV 和非EV 粒子，且较大大EV 和粘性蛋白(如纤维蛋白原或血管性血友病因子)的存在可能会堵塞毛孔，使测量不精确[39]。与 EV 尺寸范围兼容的RPS 设备具有固定孔隙和可调孔隙[39,40]，但固定孔隙设备刚推出仍有待评估，可调孔设计对于可检测的尺寸仍有一定的局限性[38,39]。

3.5 新方法

三种全新的光学方法，包括频率锁定光学低语倏逝谐振器、干涉反射成像传感器和纳米流体光纤技术，能够检测小到50 nm 的单个EV[41-43]。纳米镊子或传统的光学镊子可能能够捕获EV，并通过测量其拉曼光谱，以获得EV 的化学信息[44]。目前，这些方法仍需要进一步的研究和商业化。

4 外泌体的组分测定

在EV 内部和表面均可发现其包裹的“货物”，包括RNA、DNA、蛋白质、脂质和代谢产物。这些内含物可以转移到受体细胞，引发一系列反应。通过测量其组成成分，可以充分了解EV 的功能。

4.1 核糖核酸

EV 含有大量多样的 RNA。要研究 RNA，必须从样本中分离出EV，如前所述，应用的分离方法不同，会产生不同的结果[45]。例如，当使用DC、碘克沙醇DGC 从条件培养基中分离EV 时，会发现不同的mRNA 表达谱[46]。在这些方法中，碘克沙醇产生的EV 数量最多，非EV 组分浓度最低，表明碘克沙醇在纯度方面可能优于其他检测方法[46]。从EV 中分离出的RNA 的下一代测序已经对EV中存在的所有RNA 类型进行了综合分类[47,48]，从RNA 测序中获得的数据应该通过扩增技术进行验证，如定量PCR 或Northern 印迹[49]。在处理来自不同组织或细胞的EV 时，以及分离的EV 可能被携带的(脂)蛋白污染的情况下，这些EV-RNA 分析很难达到满意的效果[50]。

4.2 脱氧核糖核酸

尽管与EV-RNA 相比，EV 中含有DNA 的证据很少，但越来越多的研究表明，在应激条件下，细胞会释放出含有DNA 的EV，这些DNA 被证实与凋亡小体中DNA 不同[51]。与 RNA 分析一样，下一代测序、PCR 和其他方法可用于分析或验证EV-DNA 含量。

4.3 蛋白质

证明EV 中存在特定蛋白质的最广泛使用的方法是蛋白印记法(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)[52]。到目前为止，被报告的约有9700种和EV 相关的蛋白质[53,54]。关于蛋白质组学数据的分析，既可以在实验中比较选定的单个蛋白质的表达水平，也可以对所鉴定出的蛋白质进行描述、分类和分组[55]。值得注意的是，当从血液或含血清的细胞培养基中分离EV，会发生污染，即使使用无血清培养基或专用生物反应器，培养基中的可溶性蛋白质也可能导致伪影[10,11]。

4.4 代谢产物

EV 还可以携带由细胞质产生的<1500 Da 的小分子，包括糖、氨基酸、脂质、核苷酸等代谢产物。EV 代谢产物的变化可能反映了母细胞的生化状态，因此分析代谢产物可能有助于了解细胞间过程[56]。

5 小结

本综述总结了目前关于EV 样本收集、分离、检测及下游分析的常见方法，并指出不同方法对结果可能造成一定偏差。认识到从样本采集到EV检测所有步骤之间的相互关联性，将有助于避免EV 研究中出现一些常见的错误。随着该领域的进步，我们相信将会涌现出越来越多更灵敏、精确的标准化方案。总之，本综述将有助于探索EV 这一仍然新颖的领域及其在健康和疾病中的作用。