微生物酶技术在生鲜食物安全检测中的应用

张锐毅，王 超

（四川卫生康复职业学院，四川 自贡 643000）

0 引言

人口老龄化加剧了对生产高营养价值食品的需求，尤其是新鲜水果和蔬菜［1］。但是，在这些新鲜水果和蔬菜中可能会残留大量的农药。比如像印度这样的发展中国家，农业中大量使用杀虫剂已经成为一种非常普遍的做法，这些有害农药在水果和蔬菜中的残留浓度显著增加［2］。食品中残留的农药对人类具有潜在的毒害，可能会导致严重的健康问题。在不同的农药暴露途径中，最常见的暴露途径是直接食用的生鲜食品［3］。拟除虫菊酯类农药具有稳定性和高效性的特点，在农业生产中广泛应用于病虫害的防治［4］。例如，氯氰菊酯在果蔬农产品的病害虫防治方面得到广泛应用，因其具有杀虫能力强、药效持久的优点［5］。但是长期、广泛使用后，拟除虫菊酯类杀虫剂会大量残留于食品和周围的环境，这会给人体的健康和自然环境带来严重危害。拟除虫菊酯类农药会影响人体的生殖器官和激素水平，引起脑组织的应激反应等［6-7］，所以严格把控新鲜水果和蔬菜以及由新鲜农产品制成的食品中拟除虫菊酯的残留量至关重要［8］。

生鲜食品的农药残留检测是生鲜食品安全控制的一个重要环节，微生物酶技术广泛应用于谷物、肉类、果蔬的加工与检测。酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法等由于具有灵敏度高、特异性强等优点，在食品安全的检测中得到广泛应用［9-10］。其中，食品检测中常用的方法有酶联免疫分析法和酶生物传感器法，前者可用于果蔬中农药残留的快速检测，并对农药成分进行分析［11］，这种方法方便快捷、检测成本低，对于保质期要求较高的生鲜食品农药安全检测，具有很好的实用性［12］。有学者将ELISA技术运用于尿白蛋白的检验，提出了一种尿白蛋白的竞争性酶联免疫吸附方法（CELISA）［13］。袁利鹏等［14］建立了一种适用于水产品中组胺检测的间接竞争性酶联免疫分析方法（icELISA），该检测方法的准确性和灵敏度高。在奶类制品中青霉素G残留量的检测中，王玉珍等［15］建立了一种有较高灵敏度和较强特异性的icELISA方法。Tang等［16］建立了一种竞争间接酶联免疫吸附试验（icELISA）和多试纸传感器检测方法，可以快速准确地对真菌毒素和杀虫剂进行检测。一种较新的免疫分析技术—开放式三明治酶联免疫分析法可以对小分子物质，如药物、激素等，进行非竞争性的检测，该方法灵敏度高、检测范围广［17］。为了得到更准确的结果，在酶联免疫法进行检测时可以结合高效液相色谱法进行结果确认。通过气相色谱/液相色谱—质谱联用技术可以检测在水果和蔬菜的杀虫剂残留物，利用HPLC-MS液相色谱—串联质谱法和酶联免疫法可以对检测人血清中的25-羟基维生素D［18-19］。在食品安全检测中，可以利用生物酶与纳米材料将信号进行放大来提高分析检测的性能［20］。Ji等［21］利用介孔硅纳米球制备了一种新型的酶—抗体偶联物，该偶联物放大了标记信号，大大提高了酶联免疫吸附试验在检测食品中农药和兽药残留量的准确度。

在此次研究中，利用间接竞争ELISA检测方法对拟除虫菊酯类农药及其在人体中的代谢产物进行检测，并对该方法进行优化，为生鲜食品中的农药残留检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪 器：AMR-100酶 标 仪（杭 州）、UV-5100紫外-可见光分光光度计（北京）、96孔白色发光板（深圳）、LYNX4000高速冷冻离心机（Thermo）、ZHP100M型恒温振荡培养箱（江苏）。

试剂：拟除虫菊酯对照品（西安，99%）、拟除虫菊酯单克隆抗体（无锡）、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体（北京索莱宝）、鸡卵清蛋白（OVA，Sigma，98%）、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（广州，99%）、3-苯氧基苯甲酸（3-PBA，日本，98%）、吐温-20（广州，96%）、明胶、吐温-20（广州，96%），咪唑（Sigma）、多聚辣根过氧化物（HRP）酶标记的链霉亲和素（S-HRP，Thermo）。其余试剂均来自国药集团，纯度为分析级。ELISA缓冲溶液的配制与参考文献方法相同［22］。显色液TMB为实验室前期自制。

1.2 试验方法

1.2.1 拟除虫菊酯类农药的间接竞争ELISA检测方法

1.2.1.1 包被抗原的合成与鉴定 鸡卵清蛋白与3-苯氧基苯甲酸分别通过混合酸酐法与EDC法进行偶联制备包被抗原。反应摩尔比（3-苯氧基苯甲酸∶鸡卵清蛋白）分别为30∶1、45∶1和60∶1。使用200～400 nm之间的UV波长检测鸡卵清蛋白、3-苯氧基苯甲酸和包被抗原。

1.2.1.2 包被抗原、抗体亲和常数的测定 各包被抗原、抗体的亲和常数值Ka是利用非竞争ELISA方法进行测定的。将抗原和抗体分别稀释至4和8个浓度，浓度1～10 μg/mL，进行两两交叉分布测定，每组平行3次。利用公式（1）计算Ka值。

式（1）中，每个数据组中2种包被抗原的浓度之比表示为n，n＞1；当OD450nm降至一半时所对应的抗体浓度分别表示为[Ab′]t和[Ab]t，单位为mol/L。

1.2.1.3 间接竞争ELISA方法的具体操作过程 包被：加入包被抗原，100 μL/孔，在37 ℃的恒温环境下水浴2 h，然后用洗涤液洗涤3次，250 μL/孔。封闭：加入封闭液，100 μL/孔，在37 ℃的恒温环境下封闭2 h，然后用洗涤液洗涤3次，250 μL/孔。竞争反应：先后加入拟除虫菊酯对照品和抗体，50 μL/孔，在37 ℃的恒温环境下水浴30 min，然后用洗涤液洗涤3次，250 μL/孔。显色：将新鲜配制的显色液置于37 ℃的恒温环境下避光反应15 min，100 μL/孔，然后加入终止液50 μL/孔。测定：样品的OD450nm值用酶标仪来进行测定。

1.2.1.4 建立拟除虫菊酯标准抑制曲线 拟除虫菊酯在不同质量浓度下的OD450nm值采用间接竞争ELISA法进行测定，利用Origin软件将检测得到的结果进行Logistics函数拟合，可以得到拟除虫菊酯的标准抑制曲线，利用标准抑制曲线计算拟除虫菊酯的抑制中浓度（IC50）。

1.2.1.5 拟除虫菊酯的交叉反应试验 利用标准抑制曲线计算出其他拟除虫菊酯的抑制中浓度，利用公式（2）计算抗体与所有拟除虫菊酯和半抗原的交叉反应率（Cross-reactivity，CR）。

式（2）中，P代表IC50时的基准物质；A代表IC50时的类似物。

1.2.2 拟除虫菊酯代谢产物3-苯氧基苯甲酸的检测方法 在前期获得3-苯氧基苯甲酸纳米抗体的基础上，进行3-苯氧基苯甲酸纳米抗体生物素化试验。用碳酸缓冲液将包被原稀释至试验所需的浓度，向酶标板中以100 μL/孔的剂量加入稀释溶液，并在37 ℃恒温水浴中放置过夜。第2天用300 μL含0.005%吐温-20的咪唑—磷酸盐缓冲溶液（IPBS）洗涤2次，然后将酶标板置于吸水纸上拍干。接下来，在酶标板上加入蛋白封闭液120 μL/孔，置于37 ℃恒温水浴中静置3 h，然后倒掉液体并在吸水纸上将酶标板拍干，在37 ℃温度下进行干燥后用于试验或者置于4 ℃环境下密封保存备用。用咪唑—磷酸盐缓冲溶液将3-苯氧基苯甲酸纳米抗体和3-苯氧基苯甲酸标准品稀释至试验中所需的浓度，将各为50 μL的抗体稀释液和3-苯氧基苯甲酸标准品溶液加入至酶标板中，在37 ℃恒温水浴中孵育40 min，然后将酶标板洗涤5次后置于吸水纸上拍干。用咪唑—磷酸盐缓冲溶液将S-HPR稀释至试验所需的浓度，向酶标板中加入100 μL/孔，在37 ℃恒温水浴中孵育30 min，然后将酶标板洗涤5次后置于吸水纸上拍干。向酶标板中加入100 μL/孔的TMB显色液，在37 ℃恒温水浴中反应10 min，然后向每孔中加入10% H2SO4终止液50 μL，用酶标仪测定酶标板各孔在波长450 nm处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 拟除虫菊酯类农药检测方法结果与分析

2.1.1 包被抗原的鉴定 3-苯氧基苯甲酸作为包被半抗原是根据拟除虫菊酯的母核结构来进行选取的。与鸡卵清蛋白（277 nm）相比，包被抗原的特征吸收波长（288 nm）出现红移，这是由于3-苯氧基苯甲酸（291 nm）起生色团作用造成的，扫描结果如图1所示。包被抗原的特征吸收波长出现红移表明包被抗原偶联成功。

图1 包被抗原紫外扫描图谱

2.1.2 包被抗原的筛选

2.1.2.1 包被抗原与抗体最佳工作浓度的测定 ELISA中包被抗原和抗体的最佳工作浓度采用方阵滴定法确定。根据检测方法的要求，最佳工作浓度为所有浓度中抗原、抗体用量较少且1.2≤OD450nm≤1.5。经过测定，可以得到抗体和包被抗原的最佳工作浓度，抗体为0.25 μg/mL，包被抗原的特性见表1。

2.1.2.2 包被抗原与抗体的亲和常数测定 抗原与抗体结合力的大小可以用亲和常数Ka来反映，一般认为抗体的亲和常数在107～1012L/mol范围内时亲和力较高。6种包被抗原与抗体的Ka值结果见表1，亲和常数均大于107L/mol ，表明抗原与抗体结合能力强。在试验范围内，反应摩尔比越大，亲和常数越大，亲和力越高。此外，对通过不同方法制备的包被抗原与抗体亲和力进行比较，混合酸酐法比EDC法中的亲和力更高。

表1 包被抗原的最佳工作浓度与亲和常数

2.1.2.3 交叉反应筛选最佳包被抗原 交叉反应的结果通过间接竞争ELISA方法进行测定。在所有的包被抗原中，MA2包被可以识别8种拟除虫菊酯，数量最多且灵敏度最高。对包被抗原中的各项指标进行综合比较可得，偶联方法和反应比对Ka值、工作质量浓度、灵敏度以及交叉反应均有显著影响。通过混合酸酐法制备得到的包被抗原比通过EDC法得到的包被抗原用量少，更容易与抗体结合，识别的拟除虫菊酯数量最多且灵敏度最高。同时，混合酸酐法在不同反应比的条件下得到的包被抗原指标也具有差异性。综合分析，本次试验中选择了反应比为45∶1的MA2作为最佳包被抗原进行方法建立。

2.1.3 间接竞争ELISA方法的条件优化

2.1.3.1 对照品稀释液溶剂与浓度的优化 拟除虫菊酯类易溶于有机溶剂，进行对照稀释液的配制时，在不添加对照的情况下，选择不同的有机溶剂，考察其是否会对抗原抗体的结合能力产生影响。结果显示，试验中选择的有机试剂可以显著影响抗原抗体的结合，由于体积分数的差异，有机试剂对抗原抗体的结合存在促进或抑制的影响，如图2所示。所有有机溶剂中甲醇产生的作用最小，所以本次试验选择甲醇作为对照稀释液的有机溶剂。

图2 有机溶剂对OD450 nm值的影响

对甲醇的含量影响进行测度，结果如图3a所示。从图中可以看出，对于抑制曲线和灵敏度而言，体积分数为10%～40%的中低浓度甲醇产生的影响较小；体积分数为50%～60%高浓度甲醇会降低拟除虫菊酯的抑制作用。为了减少有机溶剂对反应体系的影响，试验中选择添加10%的甲醇。

图3 甲醇体积分数和离子强度对OD450 nm值的影响

2.1.3.2 抗体稀释液中离子强度的优化 离子强度对间接竞争ELISA中抗原—抗体的结合反应有重要影响，其对OD450nm值的影响见图3b。当离子强度的浓度为5 mmol/L时，IC50值升高，灵敏度下降；当浓度为10 mmol/L时，灵敏度高且抑制曲线无异常变化；当浓度≥20 mmol/L时，抗原未与抗体结合。因此，本次试验选择10 mmol/L的离子浓度。

2.1.3.3 抗体稀释液pH值的优化 pH值对间接竞争ELISA中抗原—抗体的结合反应也有重要影响，如图4所示。当pH值的范围为6.0～8.5时，OD450nm的最小值差异较小，拟除虫菊酯具有相似的抑制效果；当pH值不同时，OD450nm的最大值差异较大，证明pH值可以显著影响抗原抗体的结合能力。综合考虑，选择pH值7.5对抗原抗体结合能力的影响最小。

图4 pH值对间接竞争ELISA的影响

2.1.4 甲氰菊酯标准抑制曲线 对上述影响因素进行优化后，可以绘制出甲氰菊酯的标准抑制曲线，具体见图5。在标准曲线的检测限为1.32 ng/mL，线性范围为2.65～28.55 ng/mL，IC50值为8.69 ng/mL。

图5 甲氰菊酯的标准抑制曲线

2.1.5 测定拟除虫菊酯交叉反应率 表2为8种拟除虫菊酯类农药的交叉反应结果，其余药物无IC50值和CR值。结果显示，本次试验中建立的方法对甲氰菊酯的检测灵敏度最高，在对甲氰菊酯、氯氰菊酯、苯醚氰菊酯、氟氯氰菊酯的检测中CR＞10%，产生了较强的交叉反应；在对高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯苯菊酯和顺式氰戊菊酯的检测结果为：1%＜CR＜10%，产生了中等强度的交叉反应；在对氯菊酯、右旋苯醚菊酯、联苯菊酯和3-苯氧基苯甲酸的检测中未发生交叉反应。

表2 8种拟除虫菊酯类农药的交叉反应结果

2.2 拟除虫菊酯代谢产物的检测方法结果与分析

2.2.1 3-苯氧基苯甲酸生物素化 3-苯氧基苯甲酸纳米抗体生物素化后选择酶标物S-HPR进行间接竞争ELISA检测，当包被质量浓度和抗体的工作质量浓度分别为125 ng/mL与500 ng/mL时，生物素化的3-苯氧基苯甲酸纳米抗体在1 μg/mL的3-苯氧基苯甲酸标准溶液中的抑制率为92.2%，说明3-苯氧基苯甲酸纳米抗体生物素化成功。

2.2.2 间接竞争ELISA的方法优化

2.2.2.1 最佳稀释倍数和浓度组合的优化 利用棋盘滴定法分别稀释包被原和抗体，当3-苯氧基苯甲酸质量浓度为0时，用酶标仪测度间接竞争ELISA法中不同的抗原抗体浓度组合在波长450 nm下的吸光值。选择吸光值在［1，1.5］之间的浓度组合，然后将药物进行梯度稀释，利用间接竞争ELISA法绘制抑制曲线，可以得到各个抑制曲线的IC50值和最大吸光度，如图6所示。综合考虑，包被浓度和抗体稀释倍数分别为125 ng/mL和1∶2000时曲线的拟合度较好，此时最大吸光度/IC50的值最大。

图6 包被浓度的优化

2.2.2.2 缓冲液pH值的优化 pH值过高或过低都会影响抗体的活性和溶解度，也会对药物的溶解度造成影响。本次试验中测定3-苯氧基苯甲酸抑制曲线的反应体系pH值分别选定为5.6、6.6、7.6、8.6和9.6。如图7a所示，当pH值为6.6左右时，最大吸光度/IC50的比值最大，因此最佳缓冲液的pH值选择6.6。

2.2.2.3 最佳吐温浓度的优化 吐温浓度对间接竞争ELISA法的灵敏度会产生影响。试验中将咪唑—磷酸盐缓冲溶液中添加的吐温-20的体积分数 分 别 设 置 为0.001%，0.005%、0.010%、0.025%和0.500%，考察不同浓度的吐温-20对间接竞争ELISA法灵敏度的影响情况。从图7b中可以看出，当体积分数为0.005%时，抑制曲线中最大吸光度/IC50的比值最大，因此最佳吐温浓度选择0.005%。

图7 pH值和吐温含量的优化

2.2.2.4 缓冲液离子浓度优化 本试验选用磷酸盐浓度分别为10、20、40、60 和80 mmol/L的咪唑—磷酸盐缓冲溶液作为反应体系，测定3-苯氧基苯甲酸的抑制曲线。如图8a所示，最大吸光度随离子浓度的上升呈下降趋势，IC50值先下降后上升。最大吸光度/IC50值最大时的离子浓度为40 mmol/L，此时的灵敏度最大。

图8 离子浓度和S-HRP稀释倍数的优化

2.2.2.5 S-HPR稀释倍数的优化 在将上述间接竞争ELISA法中的影响因素进行优化后，在已经优化条件的基础上用最佳浓度缓冲液将S-HPR稀释后进行检测。如图8b所示，当S-HPR的稀释倍数为1∶4000时，抑制曲线的最大吸光度/IC50值最大，因此选择的S-HPR的稀释倍数为1∶4000。

2.2.3 线性范围及检出限 通过上述条件的优化，可以得到此次试验中所需要的最优反应条件：最佳包被浓度和抗体稀释倍数分别为125 ng/mL和1∶2000、最佳pH值选择6.6、最佳吐温浓度选择0.005%、最佳离子浓度为40 mmol/L、S-HPR的稀释倍数选择1∶4000。在这个条件下，配制建立标准曲线所需要的3-苯氧基苯甲酸的系列对照品溶液，质量浓度的取值范围为0.032、0.16、0.8、4、20、100、200 ng/mL。横坐标为3-苯氧基苯甲酸质量浓度的对数值，纵坐标为该浓度在450 nm下的吸光度值，利用Origin绘图软件进行标准曲线的绘制。经过计算后能够得到该曲线的IC50值为1.71 ng/mL，在试验过程中可以进行检测的线性范围为0.37～7.40 ng/mL，最低检测量即检测限的值为0.15 ng/mL。标准曲线的结果如图9所示。

图9 3-PBA的间接竞争ELISA标准曲线

2.2.4 样品检测

2.2.4.1 人尿样本基质效应的消除 试验组收集不同人的4份尿液样本（阴性），在通过0.22 μm的滤膜处理后，分别用pH值为6.6的40mmol/L咪唑—磷酸盐缓冲溶液分别稀释至1、2、4和8倍用于3-苯氧基苯甲酸对照品的配制，同时用咪唑—磷酸盐缓冲溶液稀释3-苯氧基苯甲酸对照品作为检测的对照组，分别绘制试验组和对照组的标准曲线。结果显示，人尿样本在进行过滤处理后，需要将其稀释20倍才能将基质产生的干扰进行消除，降低了方法的灵敏度，如图10a所示。为了提高检测方法的灵敏度，对前处理方法进行优化。首先，将尿液样本进行高温酸水解处理，然后利用SPE柱对高温酸水解处理的尿液样本进行纯化和富集，最后再对样本进行稀释处理。如图10b所示，将前处理方法进行优化后，对照组与试验组的标准曲线基本重合，优化后的方法可以显著提高样本检测的灵敏度，稀释倍数为8时即可消除基质效应。

图10 不同处理方法对样本基质的影响

2.2.4.2 水样本 取自来水、矿泉水、井水和河水4种不同来源的环境水样，将水样本进行离心和0.22 μm的滤膜过滤处理后，分别用pH值为6.6的40 mmol/L咪唑—磷酸盐缓冲溶液稀释至1、2、4和8倍用于3-苯氧基苯甲酸对照品的配制，同时用咪唑—磷酸盐缓冲溶液稀释3-苯氧基苯甲酸对照品作为检测的对照组，分别绘制试验组和对照组的标准曲线。结果显示，4种不同来源的环境水样对照组与试验组的标准曲线高度重合，说明不同环境的水样本产生的基质效应较小，对样本的检测不造成干扰，所以对环境水样本的处理在离心、过滤后即可进行检测。

2.2.5 加标回收率与相对标准偏差 采集8份人尿样本和环境水样本作为阴性空白样品，在检测范围内选择高、中、低浓度分别进行样本的添加回收试验，取3次平行试验的平均值。结果显示，人尿样本的添加回收率在87%～99%之间，环境水样本的添加回收率在78%～127%之间。

3 结论

3.1 拟除虫菊酯类检测方法的结论分析

通过最佳各工作质量浓度、Ka值、交叉反应等指标，对EDC法和混合酸酐法进行筛选，建立了通过混合酸酐法制备，选择反应比为45∶1的MA2作为最佳包被抗原的检测方法。咋绘制甲氰菊酯的标准抑制曲线时，对离子强度、pH值和甲醇含量进行优化，并确定了竞争反应的最佳条件，离子强度的选择为10 mmol/L，pH值为7.4，甲醇含量为10%。利用标准曲线，测定11种拟除虫菊酯类农药的交叉反应。结果显示，间接竞争ELISA可以对8种拟除虫菊酯同时进行检测，灵敏度可以达到8.69～344.97 ng/mL，说明该方法能够有效地进行多种拟除虫菊酯类农药的残留检测。

3.2 拟除虫菊酯代谢产物检测方法的结论分析

本次试验在前期获得3-苯氧基苯甲酸纳米抗体的基础上，进行3-苯氧基苯甲酸纳米抗体生物素化试验，对包被浓度、抗体稀释倍数、pH值、吐温浓度、最佳离子浓度和S-HPR的稀释倍数进行了优化，在此基础上建立了3-苯氧基苯甲酸的间接竞争ELISA分析方法。经过计算后可以得到3-苯氧基苯甲酸的IC50值为1.71 ng/mL，在试验过程中可以进行检测的线性范围为0.37～7.40 ng/mL，检测限的值为0.15 ng/mL。对8份人尿样本和环境水样本进行添加回收试验，人尿样本的添加回收率在87%～99%之间，环境水样本的添加回收率在78%～127%之间，RSD值均小于10%。结果证明，3-苯氧基苯甲酸的间接竞争ELISA分析方法准确性高，可以用于拟除虫菊酯类农药的检测。

综上所述，本次试验建立的间接竞争ELISA检测方法可以用于拟除虫菊酯类农药及其代谢产物的检测，该方法能够有效地进行多种拟除虫菊酯类农药的残留检测，且准确性、灵敏度高。