铁皮石斛RRT家族全基因组鉴定及表达分析

聂 聪，龙小琴，何基泽，孙语钒，赵欣宇，王万军，朱乾坤

(西南交通大学 生命科学与工程学院，成都 610031)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)是一种名贵的中药材，主要分布于云南、贵州、四川等地。多糖是铁皮石斛的主要成分之一，主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖等多种单糖组成[1-2]，且具有极高的药用价值。汤志远等[3]研究发现铁皮石斛多糖可提高糖尿病小鼠的血清胰岛素水平，降低其空腹状态的血糖值，具有降低血糖的良好作用；宁晓妹等[4]研究发现长期喂食铁皮石斛多糖可有效降低小鼠的体质量增长率；钟惠娟等[5]研究发现铁皮石斛多糖能够抑制高糖诱导的血管内皮依赖性舒张功能；张珊珊等[6]研究发现免疫力低下的小鼠在喂食铁皮石斛多糖后免疫调节作用显著增强；陈舜让等[7]研究发现铁皮石斛多糖可以减轻过氧化氢对HaCaT细胞的损伤作用。

糖基转移酶在植物中广泛存在，可将活性糖基从核苷糖(通常为UDP-glucose)转移到小分子受体上，使其糖基化，从而影响植物的代谢平衡、生长发育及应对非生物胁迫的能力[8]。UDP-糖基转移酶(UGT)是糖基转移酶家族数量最多[9]，主要有以UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-木糖等为供体的糖基转移酶[10]。近年来，愈来愈多的研究表明UDP-糖基转移酶在植物应对非生物胁迫中发挥着重要的作用，葡糖基转移酶UGT91Q2的下调可以提高茶树对冷胁迫的耐受性[11]；在盐、干旱、脱落酸胁迫下，拟南芥UDP-葡萄糖基转移酶74E2可以提高种子的发芽率[12]；张一凡等[13]研究发现杨树糖基转移酶GT14家族中有3个基因参与盐胁迫响应。

Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖(rhamngalacturonan-Ⅰ,RG-Ⅰ)包含重复的结构单元 [→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-l-Rhap-(1→ ]，其GalA可在O-2及O-3处被乙酰化，与同型半乳糖醛酸聚糖类似[14]，RG-Ⅰ的合成需要半乳糖醛酸转移酶、鼠李糖基转移酶、半乳糖基转移酶和阿拉伯糖基转移酶等[15]，但参与RG-Ⅰ主干合成的糖基转移酶研究较少。最近的研究在拟南芥中发现了编码鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶(rhamnogalacturon Ⅰ rhamnosyltransferase，RRT)的AtRRT1，其可将UDP-β-Ⅰ-鼠李糖中的鼠李糖残基转移到RG-Ⅰ寡糖上[16-17]。目前，关于RRT在铁皮石斛多糖合成中鲜见报道，本研究根据AtRRT的蛋白序列进行BLAST比对，在全基因水平筛选到7个铁皮石斛RRT (DoRRT)蛋白序列和4个DoRRT基因，剔除冗余序列后得到4个DoRRT蛋白序列，并进行系统进化、保守基序、基因结构及表达特性等分析，为深入研究DoRRT生物学功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以在西南交通大学植物组织培养室光照培养箱中生长的5月龄的铁皮石斛幼苗为试材，光照培养箱的条件设定为：22 ℃，16 h光照/8 h黑暗，光照强度为100 μmol·m-2·s-1。

1.2 试验方法

1.2.1 DoRRT蛋白的理化性质及亚细胞定位分析 从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载拟南芥RRT家族的蛋白序列，在BLAST中选择Protein BLAST，将物种限定在铁皮石斛中进行搜索，下载铁皮石斛的RRT蛋白序列，去除冗余序列，最终选取XP_028556032.1、XP_020691735.1、XP_028555770.1、 XP_020703023.1进行研究。在ProtParam在线网站(https://web.expasy.org/protparam/)分析DoRRT蛋白家族的理化性质，如氨基酸长度、分子质量、等电点、不稳定系数、脂肪系数及总平均亲水系数。在Plant-mPLoc[18]在线网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)对DoRRT蛋白家族进行亚细胞定位 分析。

1.2.2 DoRRT家族的系统进化树分析 从NCBI数据库下载大豆(Glycinemax)、油棕(Elaeisguineensis)、拟南芥(ArabiDopsisthaliana)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)、水稻(Oryzabrachyantha)、椰子(Cocosnucifera)的RRT蛋白序列。用MEGA-X邻近法构建进化树，建树结果在ITOL(https://itol.embl.de/)中进行美化。

1.2.3 DoRRT蛋白质序列比对及保守基序分析 从NCBI数据库下载铁皮石斛RRT蛋白序列，并将其导入MEME[19]在线网站(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)进行分析，将motifs的数量设定在10，其他参数默认。将DoRRT蛋白序列导入MEGA-X中构建进化树。从NCBI数据库中下载DoRRT蛋白的保守结构域，利用TBtools[20]绘制DoRRT保守基序、保守结构域、进化树图。将DoRRT蛋白的ClustalW比对结果导入ESPript 3.0在线网站(https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)进行可视化分析。

1.2.4 DoRRT蛋白质二级、三级结构预测 分别在SOPMA在线网站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和Phyre2[21]在线网站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)对DoRRT蛋白的二级、三级结构进行分析，参数默认。

1.2.5 材料处理 在其他培养条件相同的情况下将铁皮石斛幼苗分别置于100 mmol·L-1NaCl、5 μmol·L-1ABA(脱落酸，Abscisic acid)、10%PEG(聚乙二醇，Polyethylene glycol)的1/2 MS(Murashige and Skoog)培养基中处理6 h。同时将1/2 MS培养基中的铁皮石斛幼苗在40 ℃和4 ℃处理6 h，吸干水分后将幼苗分装，迅速置于液氮中1 min，取出放入-80 ℃冰箱保存，待用。

1.2.6DoRRT基因家族表达分析 用购自北京擎科生物科技有限公司的RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒分别提取铁皮石斛幼苗根、茎、叶和6种处理后的铁皮石斛幼苗的总RNA，并用购自TaKaRa的PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA合成，再以cDNA为模板，用购自北京擎科生物科技有限公司的 2×TSINGKE Master Mix及相应引物进行PCR扩增。PCR扩增程序为：98 ℃预变性2 min； 98 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，变性-退火-延伸共35个循环；72 ℃继续延伸10 min。PCR结果以EF1α为内参基因进行相对定量。每个PCR试验重复6次。逆转录PCR引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 DoRRT蛋白家族理化性质及亚细胞定位分析

从铁皮石斛全基因组水平上筛选出的4个DoRRT蛋白分别命名为DoRRT1、 DoRRT2、 DoRRT3、DoRRT4(表2)。理化性质分析表明DoRRT2蛋白序列的氨基酸数目为530 aa，分子质量为61.04 ku，其余DoRRT蛋白序列的氨基酸数目为491～502 aa，分子质量为56.08～ 57.72 ku；DoRRT蛋白的等电点为8.82～9.35；DoRRT蛋白的不稳定系数为41.04～51.92；DoRRT蛋白的脂肪系数为 89.23～91.91；DoRRT蛋白的总平均亲水系数均为负数，为 -0.298～-0.247，表明DoRRT蛋白均为亲水蛋白质。DoRRT蛋白的亚细胞定位结果显示DoRRT1定位在高尔基体和细胞核，DoRRT2定位在高尔基体，DoRRT3定位在高尔基体和细胞质，DoRRT4定位在高尔基体。

表2 DoRRT蛋白家族理化性质Table 2 Physical and chemical properties of DoRRTs

2.2 DoRRT家族系统进化分析

从NCBI数据库下载大豆(Glycinemax)、油棕(Elaeisguineensis)、铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)、拟南芥(ArabiDopsisthaliana)、茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)、水稻(Oryzabrachyantha)、椰子(Cocosnucifera)的RRT蛋白序列。用MEGA-X邻近法构建进化树，如图1。结果显示这7个物种的34个RRT蛋白聚为4组(A、B、C、D)，A组的RRT蛋白共有5个，B组的RRT蛋白共有5个，C组的RRT蛋白共有6个，D组的RRT蛋白共有18个，其中DoRRT2和DoRRT4蛋白共同聚类在B组 ，DoRRT1、DoRRT3蛋白共同聚类在D组。 DoRRT2、DoRRT4亲缘关系较近，可能是由于比较近的基因复制造成。

Gm.大豆；Eg.油棕；Do.铁皮石斛；At.拟南芥；Nt.茸毛烟草；Ob.水稻；Cn.椰子。用MEGA-X邻近法构建进化树，序列比对采用ClustalW，选择Bootstrap method，Bootstrap replications选择500，Model选择p-distance，Gaps/Missing Data Treatment选择Partial deletion，Site Coverage Cutoff设定为50，进行建树

2.3 DoRRT蛋白二级结构

DoRRT蛋白质预测的二级结构如表3所示。结果表明DoRRT蛋白的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲，其中DoRRT蛋白的α-螺旋的占比为44.62%～48.41%，β-折叠的占比为8.76%～9.62%，β转角的占比为 6.09%～7.54%，无规卷曲的占比为36.04%～40.37%。

表3 DoRRT蛋白二级结构占比Table 3 Proportion of secondary structure of DoRRTs

2.4 DoRRT蛋白三级结构

DoRRT蛋白三级结构如图2所示。4个DoRRT的三级结构都是基于模板c3zy6A构建的，其中DoRRT1的三级结构覆盖范围达61%， DoRRT2的三级结构覆盖范围达57%，DoRRT3的三级结构覆盖范围达60%，DoRRT4的三级结构覆盖范围达61%。在预测到的DoRRT三级结构中，α-螺旋的占比为35.06%～37.42%，β-折叠的占比为10.06%～11.2%，无规卷曲的占比为52.52%～53.65%。这与SOPMA中预测的二级结构占比有差异，可能是由于算法差异导致。

4个DoRRT蛋白的三维结构都是基于模板c3zy6A构建的，置信度为100%

2.5 DoRRT家族结构分析

利用ClustalW对4个DoRRT蛋白进行多序列比对，结果显示DoRRT1、DoRRT3蛋白序列同源性较高，DoRRT2、DoRRT4序列同源性较高，4个DoRRT蛋白序列一致性达67.82%(图3)。4个DoRRT蛋白均有O-FucT保守结构域(图4-A)，DoRRT3相较于其他3个DoRRT而言，缺少motif10。4个DoRRT的O-FucT保守结构域均包括完全的motif2、motif3、motif5、motif9这4个保守基序，部分的motif1、motif4保守基序(图4-A)，表明4个DoRRT的蛋白结构高度保守。对DoRRT的基因结构进行分析发现，4个DoRRT均有2个UTR，且均位于基因的两端(图5)。

利用ClustalW对DoRRT蛋白进行多重序列比对，参数默认

A.4个DoRRT蛋白保守基序(左)和保守结构域(右)；B.保守基序示意图

从NCBI数据库中下载铁皮石斛基因组数据，用TBtools对DoRRT结构进行分析绘图，CDS表示编码区，UTR表示非编码区

2.6 DoRRT表达分析

2.6.1DoRRT在根、茎、叶中的表达 铁皮石斛多糖在不同组织中含量不同，对DoRRT在根茎叶中的表达情况进行研究。结果显示DoRRTs在铁皮石斛根、茎、叶中均有表达，且主要集中在地上部分(图6)。DoRRT1在叶和茎中的表达显著高于根中的表达量，其中DoRRT1在叶中的表达量最高，其次为茎，最后为根；DoRRT2在叶和茎中的表达量显著高于根，其中DoRRT2在茎中的表达量最高，其次为叶，最后为根；DoRRT4在根和叶中的表达量相似，而DoRRT4在茎中的表达量显著高于根和叶。在试验过程中未检测到DoRRT3的转录，可能是由于DoRRT3的表达量太低或DoRRT3是假基因所致。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=6 ，下同 the same below

2.6.2DoRRT在胁迫处理下的表达 铁皮石斛生长在悬崖峭壁上，会受到各种非生物胁迫，铁皮石斛多糖含量丰富，有可能参与非生物胁迫响应。多种糖基转移酶参与多糖的合成，因此研究非生物胁迫下DoRRTs的表达具有重要意义。对100 mmol·L-1NaCl、5 μmol·L-1ABA、10%PEG、40 ℃、4 ℃及空白对照处理6 h后的铁皮石斛的RRT基因转录水平进行研究(图7)，结果表明：除低温外，NaCl、ABA、PEG、高温胁迫处理下的DoRRT1相对表达量均降低，但与对照组相比无显著差异；DoRRT2在PEG和高温胁迫处理下的相对表达量显著低于CK组，而在其他胁迫处理下DoRRT2的相对表达量与对照组相比无显著差异；DoRRT4在NaCl和ABA胁迫下相对表达量均升高，与对照组相比无显著差异，而其在高温胁迫处理下的相对表达量极其显著低于对照组。这些结果表明DoRRTs响应非生物胁迫。

CK(对照).1/2 MS培养基中处理6 h；NaCl.含100 mmol·L-1 NaCl的1/2 MS培养基中处理6 h；ABA.含5 μmol·L-1的ABA的1/2 MS培养基中处理6 h；PEG.含10%PEG的1/2 MS培养基中处理6 h；HT.铁皮石斛幼苗在40 ℃下处理6 h；LT.铁皮石斛幼苗在4 ℃下处理6 h

3 讨 论

铁皮石斛多糖含量丰富，且种类较多，Ⅰ型鼠李半乳糖醛酸聚糖就是其中一种。通过BLAST搜索发现铁皮石斛中的4个RRT基因，系统进化树显示DoRRT2、DoRRT4蛋白聚类在一组，DoRRT1、DoRRT3蛋白聚类在一组。铁皮石斛的RRT蛋白被聚类为两组，表明DoRRT蛋白出现功能分化，具体功能有待进一步研究。因为编码鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶的AtRRT1已经被证实参与RG-Ⅰ的合成，且AtRRT1、AtRRT2、AtRRT3、AtRRT4的蛋白同源性在52%～86%，故推测DoRRT也参与铁皮石斛中RG-Ⅰ的合成。理化性质分析表明DoRRT蛋白均为亲水蛋白质，且均可定位在高尔基体，而RG-Ⅰ可作为细胞壁的组成成分，这与推测的DoRRT参与RG-Ⅰ合成的结果一致；DoRRT蛋白的α-螺旋和无规卷曲较多；4个DoRRT蛋白均有O-FucT保守结构域，且序列一致性达 67.82%；对DoRRTs在根、茎、叶中的表达特性分析发现，DoRRTs在地上部分的表达量显著高于地下部分，这与已有研究发现铁皮石斛多糖在茎中含量更高结果一致[22-23]。对不同处理6 h后的DoRRT的表达量分析发现，不同胁迫处理下DoRRTs的表达量有所差异。在高温胁迫下DoRRT2、DoRRT4的表达量均显著低于对照组，这与陈璐[24]研究发现的拟南芥糖基转移酶UGT76F1在高温胁迫下转录受到抑制结果一致。综上所述DoRRT对PEG和高温胁迫较为敏感，表明DoRRT可参与非生物胁迫响应。

糖基化可参与植物的生长发育、对逆境胁迫的防御、次生代谢产物的合成等[25-27]。研究参与糖基化的相关酶的生物学功能可以更好地从分子层面认识糖基化对植物产生影响的机理。糖基转移酶存在于所有生物中，它们可以催化糖基残基从活化的供体转到受体分子中，从而使一系列分子糖基化[28]。参与RG-Ⅰ主干合成的糖基转移酶研究较少，本研究对铁皮石斛的鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ鼠李糖转移酶进行生物信息学分析及相关表达分析，可为后续深入研究DoRRT参与铁皮石斛的多糖合成及非生物胁迫响应提供数据支撑。