化疗药物的免疫调节作用研究进展

刘正浩，杨春光，胡志全

0 引言

近年来研究显示，化疗药物除直接杀伤肿瘤细胞，还参与抗肿瘤免疫调节作用。本文主要介绍化疗药物对肿瘤细胞、免疫细胞、肠道菌群等方面的影响，并简要介绍了化疗药物与免疫检查点抑制剂联用的现状。

1 化疗药物的“前世今生”

1910年，保罗·埃尔利希等通过化学合成的方法合成化合物606来治疗梅毒，开创了化疗的先河。30年后，环磷酰胺（CTX）和5-氟尿嘧啶（5-Fu）被用于抗肿瘤治疗。自此，化疗药物迎来了爆发性地增长。随着研究的不断深入，化疗药物的抗肿瘤机制已趋于明朗：直接影响肿瘤细胞的DNA结构，干扰肿瘤细胞DNA与RNA的合成，损伤纺锤体终止有丝分裂等。化疗药物虽然能够通过以上途径有效杀伤肿瘤细胞，但是作用缺乏特异性，极易误伤正常的组织和细胞，如增殖率高的肠上皮细胞和毛囊细胞等[1]。近年来的研究发现，化疗药物不仅直接干扰肿瘤细胞的分裂增殖，还参与到了机体的抗肿瘤免疫之中，这可能是患者在化疗结束后还能长期获益的原因之一[2]。

2 化疗药物直接作用于肿瘤细胞

根据细胞死亡命名委员会（NCCD）的定义，免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death,ICD）指在具有免疫活性的同源宿主中，针对死亡细胞提供的内源性（细胞）或外源性（病毒）抗原，能够启动适应性免疫应答的一种调节性细胞死亡（regulated cell death,RCD）形式[3]。适应性免疫应答的启动离不开肿瘤抗原的呈递和抗原呈递细胞的识别，化疗药物能够参与其中，从而调节ICD[4]。诱导ICD的主要有病毒感染、放疗以及化疗药物如阿霉素（ADM）、米托蒽醌（MITX）、奥沙利铂（L-OHP）和CTX等。

2.1 促进肿瘤细胞的抗原释放和呈递

肿瘤细胞在快速的分裂增殖过程中，或者受到放化疗等的干预，体细胞突变不断增加，沉默基因的复表达等一系列因素产生大量的“新抗原”等异常多肽，是机体免疫系统特异性识别肿瘤细胞的重要靶点[5]。化疗药物发挥作用后，由IFN γ信号转导驱动的主要组织相容性复合物1（major histocompatibility complex Ⅰ,MHC Ⅰ）上调、转录组改变（如非编码RNA表达改变）和表观遗传缺陷的积累，都可能影响肿瘤细胞的免疫性多肽，从而提高其抗原性[4]。肿瘤特异性免疫反应的启动还需要T细胞顺利识别肿瘤抗原，MHC Ⅰ类分子显得尤为重要。有研究显示，在多种肿瘤类型中β-2-微球蛋白（BMG）表达下降，导致HLA Ⅰ类分子（即人类MHC分子）水平下调，肿瘤细胞无法被CD8+T细胞识别清除[6]。吉西他滨（GEM）处理后，肿瘤细胞HLA分子表达增加，出现大量新抗原，这些蛋白质大多与DNA损伤反应有关，从而促进T细胞的识别和杀伤[7]。在L-OHP的研究中也观察到了类似的变化[8]。

2.2 向抗原呈递细胞提供辅助信号

肿瘤细胞在暴露于化疗药物等ICD诱导剂的情况下，可能由于化疗药物产生的细胞表面和微环境的变化，会释放大量的损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular pattern,DAMP），与抗原呈递细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）受体结合，促进免疫应答的激活。这些损伤相关分子模式分子[9]主要有：（1）钙网蛋白（calreticulin,CRT）；（2）ATP；（3）Ⅰ型IFN；（4）激活信号高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1) ；（5）肿瘤细胞来源核酸；（6）膜联蛋白A1（ANXA1）等。

CRT是内质网中高度保守的分子伴侣，广泛参与多种细胞功能。在ICD的早期进程中，CRT从内质网迁移到细胞膜表面，在大多数情况下，同时迁移到细胞膜表面的还有蛋白二硫键异构酶家族A成员3（PDIA3；最著名的是ERp57）[10]，辅助CRT发挥作用。CRT暴露于细胞表面主要发挥以下功能：（1）充当“吃我”信号，促进巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的吞噬作用和抗原呈递；（2）CRT等热休克蛋白与抗原呈递细胞（APCs）表面的CD91分子结合，促进APCs细胞成熟，分泌细胞因子并激活Th17细胞，增加吞噬作用[11]。在化疗诱导的ICD中，CRT的迁移受到以下三个信号模块的调节：内质网应激模块，涉及到真核翻译起始因子2亚单位α（eIF2α）的磷酸化；凋亡模块，依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（caspase8）的B细胞受体相关蛋白31（BCAP31）、凋亡分子BAX和BAK的切割；胞外模块，包括CRT通过高尔基体从内质网顺行运输到质膜，依赖于囊泡相关膜蛋白1（VAMP1）和突触相关蛋白25（SNAP25）[12]。

ATP作为一种直接供能物质，主要存在于细胞内为细胞代谢提供能量。正常情况下，细胞外的ATP含量很低。然而，当细胞死亡后，细胞膜裂解，大量ATP扩散到细胞外，此时，ATP作为“导航”信号与免疫细胞表面的嘌呤能受体P2Y（P2RY2）结合，招募巨噬细胞和DC前体细胞顺浓度梯度迁移到凋亡细胞附近，发挥抗原呈递作用；同时，ATP通过激活与P2RX7结合的典型炎性小体介导免疫刺激效应[12]。在ICD中，ATP的释放依赖[13]：（1）细胞自噬过程的激活；（2）细胞凋亡中细胞凋亡蛋白酶的激活；（3）溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1）在质膜上的再定位；（4）ROCK1-依赖的细胞起泡5PANX1通道开放。以上任何环节缺失都会抑制ATP的分泌。

细胞受到病毒感染时，干扰素作用于被感染细胞，促使其分泌抗病毒蛋白，发挥免疫调节作用。Ⅰ型IFN包括IFNα、IFNβ等，除了参与组建天然免疫，还是天然免疫与适应性免疫的桥梁[14]。分泌过程主要为：（1）蒽环类药物通过“病毒模仿”刺激肿瘤细胞内双链RNA传感器TLR3识别内源性双链RNA，诱导肿瘤细胞快速分泌Ⅰ型干扰素，随后与肿瘤细胞表面的IFNα、IFNβ受体（IFNARs）结合，通过自分泌和旁分泌通路，释放CXC趋化因子配体10（CXCL10）招募多种免疫细胞，从而发挥抗肿瘤作用。这种病毒模仿的能力可能与肿瘤细胞受到蒽环类药物作用，迫于压力释放RNA有关[15]。（2）化疗药物损伤肿瘤细胞DNA后或者分裂过程中DNA错误分离产生的微核，导致双链DNA的胞质传感器环GMP-AMP合成酶（cGAS）的快速积累，激活干扰素刺激蛋白（STING），从而调控Ⅰ型IFN的分泌[16]。因此，细胞外核酸被降解会降低肿瘤细胞的免疫原性。

免疫原性细胞死亡时，会向细胞外分泌非组蛋白染色质结合蛋白HMGB1，通过结合TLR2、TLR4和晚期糖基化终末产物特异性受体（AGER，如RAGE等）介导强效的促炎作用[17]。HGMB1与DCs上的Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）结合促进了DC细胞对肿瘤细胞的抗原加工处理和呈递；HMGB1通过RAGE促进DCs成熟[12]。如果肿瘤细胞缺乏HMGB1或者免疫细胞缺乏TLR4时，无法引起ICD[18]。

ADM和MITX[19]刺激肿瘤细胞分泌膜联蛋白（ANXA1），其作用于树突状细胞（DCs）细胞表面的甲酰肽受体1（formyl peptide receptor 1,FPR1）后，活化免疫反应。阿霉素作用于野生型和FPR1−/−的小鼠后，野生型小鼠中Ⅰ型IFN表达增加，DC细胞成熟，有关细胞毒T细胞功能的基因上调。FPR1缺陷的树突状细胞无法招募到濒死肿瘤细胞周围，因此不能诱导抗肿瘤T细胞免疫[19]。

还存在一些DAMPs具有免疫抑制的作用。细胞外的ATP降解后形成的腺苷具有很强的免疫抑制能力[20]。HMGB1由于参与的PRR受体不同，受到氧化修饰或者IFN的慢性释放等因素影响下，HMGB1和IFN会从促炎作用转为抗炎作用[21]。快速有效的急性炎性反应可以促进机体的免疫反应，但持续的慢性反应却会参与到肿瘤的免疫逃避过程[22]。

目前已知的能诱导ICD的化疗药物有ADM、L-OHP、MITX等，并非所有的化疗药物都能引起ICD，并且与化学结构关系不大，比如顺铂（DDP）和L-OHP在结构上相似，但在诱导ICD的潜能上存在差异（奥沙利铂比顺铂具有更强的免疫原性）[23]。筛选ICD的金标准是在具有免疫活性的同基因荷瘤小鼠中进行免疫接种实验。将具有诱导ICD潜能的化疗药物当作疫苗接种，经过1到2周后在该小鼠上再次接种同类型的癌细胞，在随后的1到2月内观察小鼠新生肿瘤的比例及速率。在实验的最后，对依然无瘤的小鼠再次接种同种癌细胞，观察是否有肿瘤新生，从而判断是否引起ICD[3]。随着计算机技术的发展，现在可以使用生物传感器识别出钙网蛋白CRT，ATP和HGMB1的含量[24]。人工智能基于多种理化特性计算诱导ICD的概率[25]，已经在多项研究中得到证实[25-26]。

2.3 不同于ICD的免疫原性调节作用

免疫原性死亡的标志性细胞事件是：（1）ATP的释放；（2）CRT表达增加；（3）HMGB1的含量升高[3-4]。但是有研究发现[27]，在使用化疗药物多西他赛后，前列腺癌（LNCaP）等多种细胞系中并没有诱导ATP或HMGB1分泌，但是CRT和CEA等分子的表达明显增加。这虽然与ICD不符合，但是却能够显著增加细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）对肿瘤细胞的杀伤力。Hodge等[27]认为“免疫原性调节”，即肿瘤细胞暴露于非致命/亚致命剂量的化疗时，肿瘤表型发生改变，使肿瘤对CTL杀伤更敏感。IM不同于ICD而且是ICD的补充。暴露于恩杂鲁胺的转基因小鼠前列腺癌TRAMP-C2细胞系受到免疫原性调节，细胞表面的Fas和MHCⅠ类分子的表达增加[28]。这种不同于ICD的免疫调节作用意味着在复杂的免疫网络下，化疗药物影响的免疫分子或者免疫网络会参与多种免疫调节模式，可能带来不同的免疫调节结果。

3 化疗药物作用于免疫细胞

肿瘤的增殖与迁移离不开肿瘤微环境的作用。肿瘤微环境指肿瘤细胞分裂增殖的局部环境，其成分除了细胞外基质和脉管系统，还包含有大量的免疫细胞，炎性反应因子等[29]，为肿瘤细胞的生长与侵袭提供物质基础。肿瘤微环境中还存在着大量的免疫细胞如发挥抑制作用的骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）；CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）和2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）等[29]为肿瘤细胞的免疫逃避创造了条件，还存在着大量的促免疫细胞如1型肿瘤相关巨噬细胞，DC细胞和CTL细胞等。

化疗药物可以通过影响肿瘤微环境中的免疫抑制细胞来促进抗肿瘤免疫。有研究表明，使用低剂量的CTX（50 mg/kg）或者低剂量的CTX（50 mg/kg）+GEM（50 mg/kg）均可有效耗竭Treg细胞和MDSC细胞，抑制肿瘤的生长[29]。尽管全剂量的CTX可以诱导ICD参与免疫调节，但是低剂量CTX耗竭Treg细胞可能与Treg细胞中环磷酰胺挤压转运蛋白ABCB1表达水平下降有关，与ICD无关。虽然许多化疗药物如5-Fu、多西他赛（Docetaxel）等可以耗竭MDSCs，但是还有研究表示，化疗药物可能会增强MDSC的作用。MDSCs的生长发育离不开GM-CSF和G-CSF等生长因子。在人PDAC细胞系中，GEM和5-Fu等抗癌细胞毒药物治疗后，GM-CSF等炎性反应因子的基因和蛋白表达上调，促进了MDSCs的增殖[30]。接受新辅助化疗的乳腺癌患者在使用ADM和CTX治疗期间MDSC水平急剧升高[31]。化疗药物的这种两面性仍有待研究。

化疗药物还可以增强机体的抗肿瘤免疫。肿瘤相关巨噬细胞TAMs是肿瘤微环境中数量最多的抗原呈递细胞，主要包括两种亚型：（1）经典M1亚型：可以增强抗肿瘤免疫作用；（2）替代M2型：具有抗炎效应和介导肿瘤细胞免疫逃逸的作用[32]。肿瘤细胞分泌多种细胞因子促进M1向M2的转变，促进免疫抑制微环境的形成。紫杉醇（Paclitaxel,PCX）通过TLR4/NF-κB途径诱导M2型巨噬细胞向M1型转化，从而增强抗肿瘤免疫。在缺乏TLR4的小鼠中未观察到这种影响。DCs可以摄取处理肿瘤细胞的抗原，并呈递给T细胞发挥抗肿瘤效应。蒽环类药物通过趋化因子CCL2促使肿瘤病灶中DCs细胞增加[33]。肿瘤中的DCs多不成熟，无法呈递肿瘤抗原，导致肿瘤细胞无法被杀伤，但是这种现象会被GEM逆转[34]，GEM可以促进肿瘤中不成熟的DCs发育成熟，参与抗原呈递过程。CTL可以直接杀伤肿瘤细胞，是抗肿瘤免疫中重要的一环。Docetaxel[27]、培美曲塞[29]等多种化疗药物均能增强CTL的杀伤力，增强抗肿瘤免疫。

4 化疗药物作用于肠道菌群

化疗药物影响肠道菌群从而降低机体免疫力。化疗药物由于其非特异性的特点，不仅作用于肿瘤靶细胞，还能杀伤分裂旺盛的正常细胞如肠上皮细胞[1]等，因此大部分的化疗药都具有一定的胃肠道毒性，肠道内的菌群活力也会受到影响。肠道菌群定植在肠道内，种类繁多，正常情况下，菌群的构成处在动态平衡之中，构成人体的免疫保护屏障。人体免疫系统对肠道菌群中的共生菌耐受而对致病菌反应，这依赖于肠上皮中的微皱褶细胞（M细胞），其细胞表面有多种TLRs，通过识别微生物相关分子模式从而杀伤致病菌[35]。化疗药物杀伤该细胞后会导致机体杀伤致病菌能力下降，从而降低免疫力。

肠道菌群的状态也会影响化疗效果。在口服抗生素治疗的无菌荷瘤小鼠中，肿瘤周围浸润的骨髓来源细胞如中性粒细胞和巨噬细胞功能受损，活性氧类ROS产生不足，铂类药物化疗的效果较差[36]。肠道菌群也会影响PD-1抗体对恶性黑色素瘤的治疗效果[37]。肠道菌群对于紫杉醇和伊立替康引起的神经性疼痛和神经炎性反应以及5-Fu和L-OHP引起的肠黏膜炎具有一定的调节作用。因此，使用益生元或益生菌调节肠道微生物群可能会提高化疗的疗效以及缓解化疗药物的毒性[38]。

5 化疗与免疫检查点抑制剂

近年来免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是抗肿瘤免疫领域的一颗新星，与化疗药物相比，免疫检查点抑制剂具有特异性高的特点。免疫检查点[39]是在免疫反应激活后起抑制作用的一类由免疫细胞表达的分子，正常情况下可以避免免疫反应的过度激活，但肿瘤细胞会利用免疫检查点起到逃避免疫杀伤的作用。目前常用的免疫检查点抑制剂一共分为两大类：细胞程序性死亡受体1（programmed death protein 1,PD-1）/细胞程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1,PD-L1）通路抑制剂和细胞毒T淋巴细胞抗原-4（CTLA-4）通路抑制剂。虽然ICIs已经获得广泛应用，但是有效率不高[40]。然而，研究进一步发现，化疗药物除了直接干扰肿瘤细胞合成之外，还可以促进肿瘤抗原的释放与识别，使PD-L1表达上调[41]，增强ICIs的疗效。这掀起了化疗药物与ICIs联合使用的热潮。有研究表明[42]，使用纳米材料把ICIs与多西他赛组装成免疫脂质体，治疗恶性黑色素瘤时，两种药物的渗透力和杀伤力明显增加。目前还有多项临床试验正在开展，旨在能够早期长期的发挥疗效，提高有效率，降低不良事件。

6 结论与展望

化疗药物通过干扰DNA及RNA合成等机制杀伤快速分裂的肿瘤细胞，登上了抗肿瘤的舞台。百年之后，随着靶向治疗的兴起，化疗药物的免疫调节作用又引起了大家的重视。随着研究的不断进展，部分化疗药物如阿霉素，奥沙利铂等可以诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，其余化疗药物如多西他赛等，虽然无法诱导ICD，但是仍然具有一定的免疫原性调节作用。在人体错综复杂的免疫系统背景下，这说明化疗药物免疫调节的途径不止一条，参与的分子也不是寥寥几个，这需要我们继续研究免疫系统，免疫细胞或免疫分子乃至肠道菌群之间的相互作用，找出影响化疗药物诱导ICD的决定性因素，探明化疗药物参与免疫调节的途径。化疗药物以非特异性的特点发挥作用，不仅杀伤肿瘤细胞，也会误伤代谢旺盛的正常细胞，因此，如果将化疗药物直接运送到靶细胞内部，如将化疗药物装载于靶向肿瘤细胞的载体，从而可以最大程度杀伤肿瘤细胞并且保护正常细胞。由于化疗药物的靶细胞是多种多样的，因此要寻找不同靶细胞之间的特异性标志。由于不同化疗药物的免疫调节作用不同，使用靶向载体将不同的化疗药物运送到不同的靶点，可以极大的发挥每种化疗药物的作用。与此同时，免疫检查点抑制剂也应该拓展应用，发掘PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7之外的更多免疫检查点，探索内在机制、增强治疗效果。最后，化疗药物联合ICIs的临床试验正在开展，通过研究药物种类、剂量、用法等寻找最佳的联合治疗方法。随着交叉学科的快速发展，未来会涌现出更多全面的、多维度的抗肿瘤治疗方案。