N6-甲基腺苷修饰与心血管疾病关系研究

戴承晔 邓毅凡 徐笑挺 何胜虎 张晶

(1.大连医科大学扬州临床医学院，江苏 扬州 225001；2.扬州大学临床医学院 江苏省苏北人民医院，江苏 扬州 225001)

心血管疾病是中国人死亡的主要原因。据统计，近5年内心血管疾病致死率占中国人群死亡率的40%[1]，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病和心力衰竭(心衰)均为直接导致心源性死亡的病因。因此进一步发掘心血管疾病的发病机制具有重要意义。表观遗传学是近年的研究热门，在DNA不发生改变的情况下，通过RNA甲基化、DNA甲基化、基因组印记和基因沉默等多种方式使基因发生可遗传变化。其中RNA甲基化修饰被证明直接参与了心血管疾病、代谢类疾病以及恶性肿瘤的病理生理机制，且N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修饰占RNA甲基化修饰的80%以上。因此，作为心血管疾病的潜在治疗靶点，现就m6A修饰与心血管疾病的关系做一综述。

1 m6A概述

m6A修饰是指腺嘌呤的第6位氮原子发生了甲基化修饰，主要发生在信使RNA(messenger RNA，mRNA)分子的3’-非翻译区和终止密码子附近[2-3]。作为真核细胞中最普遍和最保守的RNA修饰，m6A修饰几乎影响mRNA代谢的各个方面，包括保持RNA的稳定性、RNA选择性剪接和翻译[4]，并以此影响细胞的凋亡、自噬和免疫应答等。

m6A修饰是一种由酶主导动态可逆的过程，其中有三类酶参与此过程，包括“编码器(writer)”——甲基化酶、“擦除器(eraser)”——去甲基化酶以及“读码器(reader)”——m6A阅读蛋白。甲基化酶作为“编码器”可使mRNA中的A碱基发生甲基化，形成m6A。该酶由甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase like protein 3，METTL3)和甲基转移酶样蛋白14(methyltransferase like protein 14，METTL14)及其辅助因子肾母细胞瘤1相关蛋白，以及其他蛋白如病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白、RNA结合基序蛋白15、锌指CCCH 结构域蛋白13、Casitas B系淋巴瘤原癌基因转化序列样蛋白1构成[5-6]。脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)和AlkB同源物5是m6A的去甲基化酶，它们可逆转m6A的甲基化修饰[7]。而甲基化阅读蛋白能识别m6A介导的生理行为并影响 RNA的功能。随着甲基化RNA免疫沉淀技术、甲基化RNA免疫沉淀测序和高通量测序方法的逐渐成熟，越来越多的证据显示m6A在心血管疾病中具有重要作用。

2 RNA m6A修饰在心血管疾病中的作用

2.1 心衰

心衰是一种由结构和功能性心脏异常引起心输出量减少和心腔内压力升高的临床综合征[8]。多种复杂的生物学途径网络影响了心脏的结构和功能，引起心脏收缩和舒张功能不全，这是心衰演变的关键。在射血分数降低性心衰的心肌细胞中，RNA m6A修饰发生了改变，但mRNA水平却未受影响，这意味着m6A调控与DNA转录无关。在动物实验中，特异性敲除METTL3小鼠的心脏会随年龄增长而出现心肌细胞延长，心室扩张显著增加，心脏整体功能下降，证明甲基化酶中METTL3可通过调节m6A修饰影响心脏形态和功能[9]。

除了含有METTL3的蛋白质复合物普遍负责mRNA的m6A修饰形式，去甲基化酶中的FTO催化m6A去除甲基，Berulava等[10]报道，心衰过程中m6A甲基化的水平逐渐升高，FTO表达逐渐降低，其中有大量mRNA发生高甲基化修饰，加快mRNA的降解，降低与核糖体的结合力，导致心衰更快进展，患者左室射血分数显著降低，心脏功能受损。这意味着维持FTO表达有助于通过改善心脏稳态来保护和修复心肌细胞的功能。Mathiyalagan等[11]的研究团队发现，与健康心脏组织相比，衰竭心脏的坏死区和坏死周围区m6A甲基化修饰增加，FTO表达显著降低，特别是多聚腺苷酸阳性的m6A甲基化修饰升高最为明显，正常水平的多聚腺苷酸可维持mRNA的活性、稳定性以及正常翻译，而过度的m6A甲基化在mRNA的多聚腺苷酸尾处修饰可能是导致心肌基因表达异常的主要原因。由于FTO增强了肌质网钙泵mRNA的稳定性，防止肌质网钙泵的降解，发挥共转录的功能[12]，心衰时FTO表达下降，m6A甲基化修饰异常升高，肌质网钙泵蛋白表达下降，钙离子处理能力降低，心脏功能减弱[13]。而过表达去甲基化酶FTO可调节心脏中m6A修饰的水平，使心肌纤维化显著减少，并促进血管生成，改善心脏功能。总体而言，依赖FTO的心脏m6A甲基化组在心衰期间对心脏收缩起着基本的调节作用。除了m6A修饰中的“编码器”和“擦除器”外，还发现了“读码器”(或“m6A识别因子”)对心脏功能的调控。Zhang等[14]在射血分数保留性心衰患者的心肌细胞中发现，m6A甲基化相关因子与疾病相关mRNA同步增高，其中m6A阅读蛋白YTH结构域家族蛋白(YTH domain family protein，YTHDF)2通过介导mRNA降解来控制目标转录物的半衰期，而YTHDF1直接结合mRNA促进翻译并抑制细胞中Wnt/β-catenin通路的活性。

2.2 心肌肥厚

肥厚型心肌病是心肌损伤的常见原因之一，常伴有心肌肥厚等病理现象，心肌肥厚是心肌对慢性压力或容量超负荷产生的适应性反应，METTL3介导的mRNA m6A甲基化修饰对于体内和体外心肌细胞肥大的病理过程至关重要。METTL3会引起心肌细胞重构，使心肌细胞获得经刺激(如衰老和压力)引起心脏代偿性肥大的能力。同时心脏特异性METTL3敲除小鼠在体内也显示出促进偏心性心肌细胞重构和功能障碍倾向。Dorn等[9]最近的一项研究表明，METTL3可通过丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路诱导病理性心肌肥厚的发生，特异性过表达METTL3可提高MAP3K6、MAP4K5和MAPK14的水平。

FTO作为m6A甲基化修饰的去甲基化酶，可增强体外α肾上腺素刺激，抑制心肌细胞肥大，维持心肌的正常形态[15]。既往研究发现，对小鼠进行FTO基因敲除，可导致代谢性心肌肥厚发生[16]。FTO的表达降低和m6A甲基化修饰显著增高可能是压力负荷诱导心肌肥厚的重要机制。以上提示心肌细胞m6A甲基化修饰增加会导致代偿性心肌肥厚，而降低则使心肌细胞发生重构和功能障碍。

2.3 冠状动脉疾病

冠状动脉疾病是一种典型的由遗传因素和环境因素共同作用产生的常见疾病。血管损伤引起动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块形成，侵蚀血管壁，导致血管管腔狭窄和心肌缺血。Mo等[17]利用公开的全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)数据汇总结果研究了m6A单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)对冠状动脉疾病的影响，发现第15号染色体上的基因间SNP rs7173743和rs4468572十分相近，这些位点与冠状动脉粥样硬化性心脏病显著相关。

2.3.1 AS

AS是冠状动脉疾病最常见的病理改变，巨噬细胞的激活和平滑肌细胞增生与迁移影响着动脉粥样斑块。细胞炎性坏死是一种新的炎性细胞程序性死亡，已被证明与AS密切相关。Guo等[18]发现circ-0029589在急性冠状动脉综合征患者巨噬细胞中m6A修饰水平升高，降低circ-0029589上的m6A修饰水平可增加其表达，从而促进AS患者外周血单核巨噬细胞的炎症产生。AS的发生始于血管内皮细胞的功能障碍和炎症。通过检测AS患者的心血管内皮细胞，Zhang等[19]发现METTL14作为一种甲基化酶，通过m6A修饰促进成熟miR-19a的产生，从而加快AS血管内皮细胞的增殖和侵袭，影响AS斑块的稳定性。多种炎症因子可引起内皮炎症反应，导致内皮细胞通透性增加，屏障功能受损，以及黏附分子如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表达增加，导致单核细胞黏附和迁移到内皮下，进而触发AS的发生和发展。METTL14调节叉头转录因子O亚组1(Forkhead box O1，FOXO1) mRNA的m6A甲基化修饰，并通过YTHDF1识别促进FOXO1 mRNA的翻译，形成的FOXO1直接作用于VCAM-1和ICAM-1的启动子区域，上调内皮黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表达，最终导致AS的发展。此外，METTL14通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路和内皮细胞中的肿瘤坏死因子信号通路显著促进肿瘤坏死因子-α诱导的内皮细胞炎症。随后的体内试验显示，METTL14基因敲除可在小鼠中以m6A依赖的方式抑制AS斑块的形成[20]。通过以上研究表明，m6A修饰通过调节心血管内皮细胞功能、内皮细胞炎症和巨噬细胞炎性坏死，影响AS的发生和发展。

血脂异常是AS的危险因素之一，在Mo等[21]的另一项研究中，该团队证实脊髓灰质炎病毒受体相关2的3’-非翻译区位点的m6A-SNP rs6859表达与甘油三酯、总胆固醇和高/低密度脂蛋白胆固醇相关，提示rs6859可能是脂质代谢相关的多功能SNP。而高/低密度脂蛋白胆固醇、总胆固醇和甘油三酯水平正是AS明确的危险因素[22]。

Song等[23]最近研究发现，锌指蛋白217通过激活m6A去甲基化酶FTO的转录，增加FTO，降低m6A甲基化修饰水平，促进脂肪生成增加和肥胖，并以依赖m6A-YTHDF2的方式调节m6A修饰。YTHDF2和锌指蛋白217的相互作用也维持着FTO的活性。m6A甲基化修饰的功能失调可能导致包括肥胖和糖尿病在内的多种疾病的发展。上述证据证明表观遗传m6A修饰可通过各种方式参与AS斑块的形成，导致心血管事件的发生[24]。

2.3.2 急性心肌梗死

急性心肌梗死是由动脉血栓形成或粥样斑块破裂引起的心肌急性缺血性坏死。细胞自噬和凋亡与心肌细胞损伤程度相关，抑制细胞凋亡可减轻心肌梗死程度，自噬的减少通常伴随细胞凋亡的增加。研究者发现缺血心脏中FTO表达的降低可升高m6A甲基化修饰的整体水平，导致心肌细胞收缩功能增强、血管生成和纤维化减少[25]。Wang等[26]证明FTO基因可提高自噬相关蛋白5和自噬相关蛋白7的蛋白质表达，而抑制自噬可导致细胞凋亡增加，说明缺血性心肌病与自噬有关。缺血后心肌中FTO的表达降低，除自噬外，FTO调节肌球蛋白重链相关RNA转录物(Mhrt)的m6A甲基化修饰，影响Mhrt下游基因并参与心肌细胞凋亡，这意味着FTO表达的增加可延缓急性心肌梗死后不良的左心室重塑，减轻缺氧引发的心肌细胞功能障碍[27]。心肌细胞经过缺氧/复氧试验后，METTL3表达增多，促进RNA结合蛋白异质性胞核核糖核蛋白D与转录因子EB前mRNA的结合，从而降低下游靶基因转录因子EB的表达，影响腺苷酸活化蛋白激酶雷帕霉素蛋白信号通路，促进细胞凋亡，RNA去甲基化酶AlkB同源物5的过表达可作用于转录因子EB以逆转METTL3诱导的细胞损伤[28]。

2.4 血管钙化

血管钙化是磷酸钙复合物在脉管系统中的矿物质沉积[29]。Chen等[30]探讨METTL14在血管钙化的分子、细胞和器官水平的病理机制。他们发现METTL14在硫酸吲哚酚诱导人动脉平滑肌细胞中表达增加，从而诱导RNA中m6A甲基化修饰，削弱血管的修复功能。钙化动脉中METTL14的表达降低可使硫酸吲哚酚诱导的m6A甲基化修饰水平升高和人动脉平滑肌细胞钙化水平降低。由于METTL14唯一已知的主要功能是使单链核RNA中的m6A甲基化，可见m6A甲基化修饰在血管钙化中有重要作用。在人动脉平滑肌细胞的钙化模型中，下调METTL14水平可减轻钙化，促进血管修复。据此，靶向METTL14信号可能是治疗血管钙化的有效方向。

2.5 高血压

高血压是动脉内血压持续升高的一种长期状态。持续的血压升高会对肾和心脏等靶器官产生内皮细胞损伤和微循环障碍等负面影响，从而导致严重的心血管疾病。Mo等[31]发现1 236个m6A-SNP，其中有761个(11.1%)和799个(12.1%)m6A-SNP与收缩压和舒张压相关，包括rs9847953和rs197922。利用GWAS 2011和GWAS 2018的全基因组关联数据，他们还发现与舒张期血压相关的SNP存在m6A甲基化修饰。环核糖核酸(circRNA)的异常表达是多种高血压的预测性生物标志物的潜在治疗靶点，m6A对circRNA进行碱基甲基化修饰，促进细胞中circRNA蛋白质翻译的高效启动。Su等[32]绘制了缺氧性肺动脉高压中m6A circRNA的转录组全图，并确定m6A水平影响缺氧诱导肺动脉高压的血管内皮细胞中circRNA-miRNA-mRNA共表达网络的下调或上调。

3 结语

动态和可逆的m6A修饰已通过多种机制调节转录后基因的表达。m6A及其调节蛋白的失调可作为潜在的心血管疾病标志物，参与心脏内稳态、心肌肥厚、心脏重构与修复、血管内皮功能及炎性反应、血管钙化和高血压这些相关疾病，扩大了大家对心脏功能损伤的理解，并可能为修复受损心脏组织寻求新的机遇。值得注意的是，临床上有效应用FTO抑制剂和其他m6A调节蛋白抑制剂，可能会为治疗心血管疾病提供更有效的治疗策略。