树突状细胞相关胶质母细胞瘤免疫治疗研究进展

马晓良，梅敬威，徐佳鸣

（1.杭州市第一人民医院建德分院［建德市第二人民医院］肿瘤内科，浙江 建德 311600；2.蚌埠医学院第二附属医院肿瘤内科；3.浙江大学医学院附属第二医院神经外科）

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人颅脑肿瘤中最常见的原发性肿瘤，具有生存期短、复发率高等特点。临床上虽然综合使用手术切除、术后放化疗及免疫治疗等手段，但目前中位生存时间仍只有15～17个月，5年存活率仅为5.1%［1］。树突状细胞（dendritic cells，DC）作为抗原提呈细胞，目前在肿瘤生物免疫治疗上引起越来越多的重视［2］。近年来免疫治疗在肿瘤领域令人瞩目的研究进展为GBM的治疗带来曙光。本文将DC提呈肿瘤抗原相关的GBM免疫治疗研究进展作一综述。

1 GBM和中枢神经系统免疫应答

GBM在原发性脑恶性胶质瘤中约占一半，基于目前的生存期短和复发率高等特点，有必要研究出更加有效的抗肿瘤治疗方案。由于血脑屏障的存在，缺乏传统的淋巴回流系统，GBM肿瘤微环境中活化的T淋巴细胞及抗原提呈细胞数量有限［3］。有研究表明，在肿瘤微环境中，存在着多种促血管生成和免疫抑制调节因素，其中调节性T细胞（Treg）是各种肿瘤病理生理调节的关键介质。Louveau等［4］在小鼠的体外实验模型中发现了硬膜窦内淋巴回流系统，脑部的抗原提呈细胞（小胶质细胞）可离开中枢进入颈部淋巴结；同时GBM肿瘤细胞的生长可以破坏血脑屏障，有利于淋巴细胞进出脑组织，即便是血脑屏障完整，淋巴细胞在趋化因子的作用下也可穿透血脑屏障。

2 GBM的肿瘤微环境

与其他实体肿瘤相比，GBM罕见转移到中枢神经系统以外的其他部位；且GBM有较少的淋巴细胞浸润，以上这些特征提示GBM免疫微环境的复杂性［4］。虽然独特，但GBM患者的整体免疫状态是受抑制的。肿瘤是一个复杂的生态系统，由肿瘤干细胞、基质细胞、微小血管、浸润性单核细胞群和常驻免疫细胞构成。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，负责对抗感染以及对伤害的反应。在GBM中，骨髓来源的单核细胞（BMDMs）随着肿瘤细胞分泌的趋化因子如集落刺激因子1（CSF1）和CCL2而迁移到肿瘤细胞中［5］。一旦进入肿瘤内部，BMDMs发展免疫抑制表型，分泌生长因子和细胞因子，有助于促进肿瘤的生长和扩散［6］。由于基因表达的相似性，在小胶质细胞和巨噬细胞之间，很难区分是BMDMs还是小胶质细胞构成了胶质瘤相关巨噬细胞（GAMs）。细胞因子可以削弱T细胞毒性、抑制T细胞及DC的成熟和促进Treg增殖，后者又通过直接细胞接触或分泌免疫抑制因子抑制T细胞功能。此外，胶质瘤组织中存在一些骨髓来源的抑制性细胞（MDSC）。在胶质瘤体外研究模型中，研究发现肿瘤微环境中DC、成纤维细胞及巨噬细胞等可通过发生恶性转化，加速肿瘤的生长［7-8］。

3 DC的免疫学特性

研究发现，肿瘤细胞可以释放一些免疫抑制因素导致DC的功能改变，使肿瘤细胞逃避。健康者的DC含量明显多于肿瘤患者。DC与不同部位、不同类型的肿瘤的发生、发展和预后均密切相关，经证实DC的数量与淋巴转移、临床分期有关，可作为一个独立的预后因素［9-10］。DC是体内功能最强大的抗原提呈细胞，在免疫系统中能直接激活体内辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL），也可使B细胞产生抗体。肿瘤抗原体外致敏DC是通过对DC分离和纯化得来的，其可以通过高水平刺激MHCⅠ类和MHCⅡ类分子导致T细胞活化；同时诱导分泌IFN-α、IFN-γ、IL-3、IL-12等因子产生相关免疫应答；此外，还可以通过基因工程提高DC抗肿瘤免疫反应［11］。国内外动物实验研究已证实，DC肿瘤疫苗能够在动物体内诱导产生抗肿瘤特异性免疫，明显延长肿瘤动物模型的存活时间［12］。

4 DC疫苗的制备

传统体外人DC的获取方法为：取患者外周血，分离CD14+单核细胞，用重组人粒单核细胞集落刺激因子和人IL-4的完全培养基培养，第6天加入肿瘤坏死因子-α促进其成熟，第8天收获未贴壁的悬浮细胞，即为成熟DC［13］。近年来，为了提高DC疫苗的获得效率，降低成本，快速DC（Fast-DC）已经开发，大大减少了体外培养时间。“FastDC”是在2 d的培养后获得的周期并保持诱导抗原特异性T细胞反应的基本能力［14］。与标准DC相比，FastDC的重要区别在于培养的产量更高，IL-12p70释放降低，CCL19诱导的趋化因子升高，细胞内抗原表达增强，肿瘤特异性CTL细胞的招募更有效［15］。在一项针对急性白血病的研究中（NCT01734304），FastDC负载肿瘤抗原的疫苗正在行临床Ⅰ期试验，截止到目前还没发现FastDC 的不安全性［16］。Feuerstein 等［17］首 次提出，低温冷冻可被用于保存成熟DC。在DC期间的超低温保存疫苗制备是可行的，在一个小规模的临床研究中，Nair等［18］从儿童髓母细胞瘤患者中实现了PBMCs来源功能性DC的冻存。另外，Fitzpatrick等［19］研究发现，成熟DC可以被冷冻保存，冻存DC与新生成的DC相比，在存活率和细胞因子产生方面没有显著差异。综上所述，DC的超低温保存是一种实用的方法。

5 DC疫苗在GBM中的临床应用

5.1 酸洗脱抗原肽疫苗 由于GBM患者体内肿瘤细胞存在明显的多型性和异质性，因而将DC与非选择性肿瘤抗原行致敏作用可以大大提高免疫应答效率。理论上，使用此类抗原可降低免疫逃逸的概率。然而此方法一个潜在的风险就是可能导致自体免疫性疾病的发生，严重者可致实验性变应性脑脊髓炎发生。来自肿瘤细胞酸洗脱的非特异性肿瘤抗原，可有效增加与MHC Ⅰ类分子结合的肿瘤表面肽的能力［20］。Liau等［21］首次用这种方法治疗GBM患者，并利用从同种异体MHC Ⅰ类匹配的GBM中提取的肿瘤抗原对体外DC进行致敏，发现DC免疫耐受良好，没有产生自身免疫反应，肿瘤微环境中CD3+T细胞含量明显增多。Yu等［22］通过对约20例GBM患者使用 50～100 μg酸洗脱的肿瘤肽致敏的DC疫苗，每两周接种3次，每次细胞数约1×106个，所有患者均未出现疫苗相关自身免疫反应及剂量相关毒性反应；与体内未发生CTL免疫应答患者相比，有超过一半的患者体内产生肿瘤特性T淋巴细胞反应，且生存率明显延长；此外，在接种疫苗后接受肿瘤切除的患者中，有一半的患者发现肿瘤内有CD3+T细胞浸润，主要由CD8+/CD45RO+记忆性T细胞组成。

5.2 肿瘤裂解物抗原 随着酸洗脱肿瘤抗原的初步研究，利用整个肿瘤裂解物作为肿瘤抗原来源的研究也在临床开展。由于与酸洗脱相关的技术挑战（包括对大肿瘤样本的要求）和难以持续获得切除肿瘤样本的短期培养物，全肿瘤裂解物方法很快成为首选方法。肿瘤裂解液主要通过从手术室获得肿瘤标本后行快速反复冻融（通常为5～6次），产生肿瘤碎片；离心后，收集无细胞上清液，并用于与自体DC共培养；肿瘤抗原被吞噬，最终呈现在MHCⅠ类和Ⅱ类分子上。最初的研究主要集中在复发性GBM患者，后来开始研究新诊断GBM患者。然而，迄今为止，所有结果均来源于单中心非随机对照临床试验。有研究在2008年对56例复发性GBM患者进行了2期临床研究［23］。所有入组患者在接种疫苗前都接受了最大范围手术切除病灶，2例患者出现Ⅳ级脑水肿，但除此之外，疫苗总体耐受性良好。第2阶段研究的中位总生存期为9.6个月，11%的患者存活时间超过3年；对于年龄不到35岁的患者，若能够对肿瘤进行全切除，结果更好［23］。Hunn 等［24］研究表明，替莫唑胺联合肿瘤裂解物致敏DC疫苗6个月无病进展期比例为22%。在2018年的一项关于自体肿瘤裂解物致敏DC疫苗的Ⅲ期临床试验中，Liau等［25］研究发现，在GBM的标准治疗中增加自体肿瘤裂解物致敏DC疫苗不但具有可行性、安全性的特点，还能延长患者的无进展生存时间和总体生存时间。

5.3 肿瘤特异性抗原疫苗 肿瘤相关抗原（TAA）已在癌症治疗的各种临床试验中进行了验证，但个体化TAA免疫的特异性T细胞反应模式仍有待进一步探索［26］。肿瘤特异性抗原疫苗主要包括单抗原疫苗和多抗原疫苗。EGFRv Ⅲ是一个理想的免疫治疗靶点，它是由产生肿瘤特异性抗原的亚基缺失引起的，而这种抗原在正常组织中是不存在的。它存在于大约30%的GBM中。目前临床前研究表明，其对颅内肿瘤有明显的抗肿瘤活性，用EGFRv Ⅲ肽致敏的DC治疗EGFRv Ⅲ阳性肿瘤，进行了第1阶段剂量递增临床研究［27］。在这项研究中，新诊断的GBM患者在最大安全切除和标准放射治疗后，接受了3次剂量的DC疫苗，患者接受了高达5.7×107DC，未观察到剂量限制性毒性或严重不良反应；大多数患者在接种后都表现出EGFRv Ⅲ特异性免疫反应，83%的患者（10/12）在体外产生了EGFRv Ⅲ特异性T细胞增殖反应，56%（5/9）产生了EGFRv Ⅲ特异性阳性反应、迟发型超敏皮肤试验；中位进展时间和自诊断之日起的总生存率分别为10.2个月和22.8个月［27］。近年来WT1抗原相关肿瘤免疫治疗在GBM患者体内研究得到学者青睐［28-30］。在另一项Ⅰ期研究中，Sakai等［31］报道了10例复发性GBM患者的结果，这些患者接受了自体DC与突变型Wilms肿瘤1（WT1）抗原行致敏反应，免疫耐受良好，无1例患者出现3级以上不良反应；6例患者（60%）的WT1特异性CTL细胞增加了2倍以上。巨细胞病毒（CMV）抗原存在于胶质母细胞瘤中，但不存在于正常大脑中，使其成为理想的免疫靶点［32］。有研究表明通过输注CMV抗原特异性T细胞后，用高剂量的替莫唑胺进行淋巴滤过，耐受性良好，但CMV血清阳性不能保证肿瘤对CMV特异性T细胞的易感性，这表明CMV抗原表达存在异质性；此外，这些T细胞的效应器功能减弱，这表明在进行大规模临床研究之前，需要进一步调节T细胞以防止其功能障碍［33］。Wen等［34］通过 整合 MAGE-1、HER-2、AIM-2、TRP-2、gp100和 IL13Rα2等6种抗原从而制作DC疫苗（ICT-107），接受ICT-107治疗的GBM患者总体生存时间可延长2个月，但与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；但无病生存期可明显延长，差异有统计学意义（P＜0.01）。

5.4 融合细胞疫苗及其他免疫治疗 DC融合疫苗与DC负载抗原蛋白、抗原肽、肿瘤细胞裂解产物、辐照肿瘤细胞等制备的疫苗相比，不仅能更好的通过MHC Ⅰ途径进行抗原处理，将TAA通过内在途径传递给DC，从而产生高质量的抗原特异性T细胞；而且还能通过抗原的交叉激活表达MHC Ⅰ和MHC Ⅱ限制的TAA。既往肿瘤疫苗诱导的免疫反应通常为单一抗原，容易形成肿瘤抗原表达下调而致免疫耐受，而融合细胞是多克隆CD4+T细胞的有力刺激者，在SCID鼠体内应用多克隆CTL后可以使肿瘤消退。但目前临床研究较少，效果不明显。

有关DC疫苗的Meta分析表明，虽然DC疫苗的耐受性良好，但与对照干预组相比，基于DC的疫苗接种在中位总生存率、中位无病进展期、无病进展期率或总生存率方面没有明显改善；部分研究表明DC疫苗可增加新诊断的GBM的生存期，部分患者中位生存期超过2年或3年，然而，以DC为基础的疫苗接种（在第7至10周内每周进行体内接种，然后每月进行1次）显示，对照组和疫苗组在12个月时的无病进展期（28.4%vs 24.5%，P=0.9975）或中位总生存率无统计学差异［35］。因而DC疫苗未来仍有较大的挑战。

6 小结与展望

在体外将自体DC细胞负载肿瘤抗原行免疫治疗在未来GBM及其他实体肿瘤的免疫治疗中仍然是富有前景的一项治疗手段。从目前的临床试验前期结果可以发现此项治疗的安全性及有效性，部分研究结果对GBM患者综合治疗给予极大的鼓舞。然而，疫苗的制备、疫苗的成分及患者自身因素等诸多因素仍制约着此研究。此外，包括GBM在内的所有实体肿瘤，如何针对自体免疫抑制因素行相关改进，提高免疫治疗效率，值得研究者进一步深入探讨。更多提高DC疫苗疗效的免疫佐剂有待在今后的免疫治疗中发挥重要作用。基于DC的免疫治疗在GBM治疗中可谓机遇和挑战并存。前述多项研究结果均提示GBM免疫治疗的联合应用疗效可期，开发新型免疫治疗手段，并对现有研究结果进行详细分层和科学评价，或将为GBM的免疫治疗带来新的思路。