慢性疲劳综合征动物模型评价方式的现状与思考

王玉琳，刘同岩，孙玮，屈媛媛，冯楚文，王宗兴，顾冶，杨添松1，

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040； 2.黑龙江中医药大学附属第二医院针灸科，哈尔滨 150001；3.黑龙江中医药大学附属第一医院 a.针灸五科，b.针灸科，c.周围血管科，哈尔滨 150040)

慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是一种涉及多器官系统以慢性持续或反复发作的严重疲劳为特征的症候群，休息后不可减轻的脑力、体力极度疲劳为其突出表现，该病病程较长，往往伴有非特异性躯体化症状[1]。病毒感染、心理社会应激、遗传及不健康的生活方式等导致免疫功能失调或神经内分泌系统障碍均可诱发本病[2]。目前，CFS全球患病率为0.89%[3]。随着人们生活压力的逐渐增加，CFS的总体发病率呈上升趋势，且逐渐年轻化。该病主要在心理和生理两方面对患者造成影响，导致人体免疫、循环等各系统及情绪、意志发生病理性改变。在西方国家，CFS是迫使人们前往医院就医的五大原因之一。在我国，中等收入以上和低收入人群及某些特殊群体(如IT人员、医务人员及长期作息不规律者)更易患CFS，给社会和家庭造成沉重负担[4]。

因此，在CFS的研究工作中建立更为科学的动物模型有着重要的临床意义。近年来，CFS模型多以顺应性强，与人类生理相近的鼠类为主，造模成功的评价标准多样，但具体标准、方法没有统一，缺乏科学性及说服力。现就CFS动物模型的评价方式与干预措施评价标准予以综述，以为今后CFS的动物模型研究和临床研究提供帮助。

1 常用评价方式

1.1基本状态

1.1.1一般情况 一般情况包括精神状态、皮肤颜色、耳与尾部色泽、粪便情况、日进食量与日饮水量等，可作为模型动物内在疲劳程度及精神状态的外在表现，有操作简便、结果易得等优势，被众多文献作为衡量指标。但一般情况有很强的主观因素，结果可靠性不高。可以通过制作半定量量表的形式减少主观因素，增加结果可靠性。如高怀林等[5]制作的半定量量表，具体操作为将量表得分作为观察对象，以造模前后得分差异有统计学意义为标准。建立统一的基本状态的评定量表对与不同实验之间的平行对比有一定的现实意义。在量表指标采集过程中，还可以通过摄像机录像采集指标的方式，进一步减少指标采集过程中的人为干扰因素。

1.1.2体重 体重是CFS模型动物衡量标准中较易获取，且相对客观的评价指标。模型动物在CFS造模过程中的体重均表现为减轻，以实验前后体重数值差异有统计学意义为造模成功标准。可在造模开始时、进程中、完成时分次测量，动态展示体重减轻过程。但某些造模方式为模拟运动性疲劳而强迫大鼠游泳或跑步，是否因运动量增加而引起体重改变从而产生误差和偏移，值得进一步思考、探索。

1.2行为学实验

1.2.1力竭游泳实验 力竭游泳实验为强迫游泳实验的一种变体，强迫游泳实验是抗抑郁药物的筛选及相关受体的研究实验，通过观察泳池中动物模型的各种行为动作达到实验目的，可分为传统型与改良型。力竭游泳实验在此基础上做出相应改良，可以涵盖多方面刺激，如温度、体力及精神等，包含心理与身体两种应激原，更加贴合CFS心理和身体双重疲劳的特性[6]，具体做法为将实验用鼠置于水温恒定的泳池中，水深以鼠类不能接触池底为准，强制鼠类游泳，不动时用木棒驱赶，维持其运动状态。力竭标准为实验动物不能再坚持游泳动作，沉入水底数秒不能回到水面，实验用鼠达到力竭标准后，取出晾干，并记录时间。本实验既可用于造模，也可用于评价，以时间差异有统计学意义为标准，如牛占忠等[7]采用力竭游泳加睡眠剥夺方法成功建立CFS鼠类模型的同时，将力竭游泳作为造模是否成功及治疗是否有效的衡量标准。也可在实验鼠尾后增加配重，加快实验进程[8]。

1.2.2旷场实验 旷场实验最初由Hall于20世纪研发，目前应用十分广泛[9]。该实验利用鼠类畏惧空旷场地的趋避性与面对新鲜事物的好奇心之间的矛盾心理[10]，通过对旷场中鼠类的运动路程、运动速度、具体运动轨迹及在旷场中的表现(理毛行为等)的观察，检测鼠类自发活动和探索行为，一般用来检测药物的副作用。在CFS鼠类模型中，旷场实验多作为造模方法及干预措施。其具体操作与原始操作未发生较大变动，均为将鼠类放置于特定封闭旷场中，记录特定时间内鼠类行为。但观察指标略有差异，既可按照传统实验进行观察，仍将运动路程、运动速度及理毛次数作为指标，也可将跨格数量(三爪或四爪进入另一格为准)作为新的观察指标[11]。还可将跨格数作为水平运动，另加入垂直运动(两后腿支撑身体，前爪离地)和(或)中央格停留时间作为指标[12]，各指标均按实验前后差异有统计学意义为标准。该实验操作简单、可重复，所得数据表达信息丰富，一次实验就可以对动物的自发活动、探索行为及焦虑抑郁状态进行定量评价[13]，利用影像技术还可以进一步减少人为误差的影响，但需注意实验用鼠最好选用雄鼠，以最大限度避免雌鼠动情周期对结果的影响。实验时需将实验动物提前运送至实验室，使其充分适应环境，减少鼠类紧张因素对实验结果的影响。实验前及上一鼠实验结束后要及时清理装置，确认装置无味，尤其注意彻底清除上次实验留下的鼠类排泄物及气味，避免干扰。

1.2.3鼠尾悬吊实验 在CFS模型研究中，鼠尾悬吊实验主要用于衡量造模成功与否及干预措施的有效性，具体操作是将距鼠类尾尖一定距离(一般是5 cm)固定于特定实验装置上，使其呈倒悬状态，头部及前爪不能接触地面，并用纸板隔开动物视线，减少外界干扰，记录规定时间内动物不动时间，并观察动物挣扎的剧烈程度。该实验的原理为动物处于不正常体位状态时，会有自发纠正的行为，但根据不同个体的身体及心理因素，会逐渐进入一种绝望而不动的状态，而不动时间可反映个体的心理状态，并可以很好地模拟人类的抑郁状态[14]。尽管对于鼠尾悬吊实验中动物出现的不动状态是因身体因素所致，还是心理因素所致仍存在争议[15]，但因CFS具有心理、身体双重疲劳的特性，故不影响该实验在慢性疲劳研究中的应用。研究中，除以不动时间、挣扎剧烈程度为评价标准外，还可以观察实验动物的抬头次数。需注意的是鼠尾悬吊实验对动物有一定的损害，实验时间不宜过长。

1.2.4迷宫实验 迷宫实验包括许多类型，如Moriss水迷宫、高架十字迷宫、T形迷宫、放射臂水迷宫等，在CFS动物模型评价中应用较多的有Moriss水迷宫与高架十字迷宫。

1.2.4.1Moriss水迷宫 水迷宫实验是利用鼠类在水中求生的本能，对鼠类的空间位置感、方向感以及学习记忆能力等复杂生理功能进行测试[16]。经典的水迷宫实验是由定位巡航实验与空间探索实验组成，其中定位巡航实验是指从池壁随机释放受试动物，记录其找到水中隐藏逃生平台的平均时间，空间探索实验是指撤走逃生平台后，原受试动物在特定时间内跨越原平台位置的次数，后一实验中所有动物必须为同一入水点。

Moriss水迷宫实验在CFS模型评价中，可以按经典实验同时完成两个子实验[17]，也可以仅做定位巡航实验[5]，还可对其游泳速度做出测量[18]，所衡量项目均与经典实验相似，变化不大，以差异有无统计学意义为标准。与其他迷宫实验相比，Moriss水迷宫实验的优势为可减少实验鼠嗅觉对实验结果的影响，但对实验的设备要求较高，且实验人员也应注意自身及实验环境中其他物体的位移对实验结果的影响。啮齿类动物具有较良好的记忆能力，经过训练的动物在较长时间里不会忘记行动轨迹，如同一实验中造模后及治疗后均需要进行评价，需要考虑动物的记忆效应对评价的干扰。

1.2.4.2高架十字迷宫 高架十字迷宫实验设备是由一对开放的平台区(开放臂)和一对封闭的暗箱区(封闭臂)组成的“十字”构成，再将其架高，与地面有一定高度，使测试对象的探索区域相对固定。利用受试对象面对新环境(开放臂)的好奇探索与嗜暗天性(封闭臂)之间的冲突心理[19]，通过对受试对象迷宫内表现的观察，完成受试对象焦虑程度的测量。对该实验的信度检测复测显示，其结果稳定可靠，所反映的是受试对象的特质焦虑，而非状态焦虑[20]。高架十字迷宫实验在CFS模型评价中的应用普及程度较水迷宫实验低，它既可用于焦虑模型的建立，也是国际上公认的经典测量焦虑反应的方法。在此实验中，充当CFS动物模型精神状态的测量指标是由跟踪设备记录的大鼠进入开放臂次数(open arm entry，OE)、开放臂停留时间(open arm time，OT)、进入封闭臂次数(closed arm entry，CE)及封闭臂停留时间(closed arm time，CT)，并计算进入开放臂次数百分比[OE%=OE/(OE+CE)×100%]以及在开放臂停留时间百分比[OT%=OT/(OT+CT)×100%]。OE及OT减少反映大鼠焦虑情绪加重。

1.2.5抓力实验 抓力实验可以对鼠类耐力及肌肉力量做出测量，反映实验鼠类的疲劳程度。实验方法是将小鼠放置在水平固定的抓力测定仪抓力板上，抓住其尾部水平向后牵拉，待实验鼠抓牢抓力板，逐渐加大牵拉力度，直至小鼠松爪，等待仪器记录抓力数值，多次测量取平均值作为测量结果[21]，以实验鼠实验前后的测量结果差异有统计学意义为造模成功标准。因该实验仅能对小鼠体力疲劳程度做出反应，不包含心理疲劳，且需专业仪器进行测量，故在研究中应用较少。

2 客观评价指标及CFS中医分型评价标准

2.1相关客观评价指标 由于对CFS病因病机的研究不够深入，临床上CFS的诊断多以症状学为主，缺乏特异性诊断指标。其动物模型也没有特定客观指标评价，相关文献中客观评价指标多用于病因病机猜想的论证及干预措施有效性评价，现将常见的相关指标按病因病机分类整理如下。

2.1.1免疫系统指标 CFS患者与正常人群的大量对比显示，患者体内存在高水平炎症介质，提示免疫系统与CFS关系密切[22]。其可能的病理机制是在多种不良因素的长期刺激下，免疫系统处于慢性应激状态，机体形成了相对稳定的免疫反应，进而产生许多高水平炎症介质[23]。在科研工作中，可以将这些炎症介质水平作为衡量疾病发展及干预措施有效性的重要指标。在CFS动物模型中，应用较多的有白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α等[24-25]。

2.1.2神经内分泌系统指标 研究发现，CFS的发生发展与下丘脑-垂体-肾上腺轴功能异常有关，其诸多临床表现与肾上腺皮质功能紊乱的临床表现类似[26]。虽然目前对CFS鼠类模型体内下丘脑-垂体-肾上腺轴各激素含量变化仍存在争议，但皮质醇、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素作为该轴主要效应激素，其含量均被用作衡量CFS模型的重要指标。在相关实验中，神经内分泌相关指标佐证了干预措施有效性，又为CFS的发病机制做出了进一步的阐述[27-29]。

2.1.3抗氧化/氧化系统指标 抗氧化系统与氧化系统相互对立并长期处于动态平衡的关系中。当机体处于长期疲劳中，抗氧化系统不能清除所有氧化系统的自由基，这种平衡就会被打破，产生氧化应激。自由基的堆积会影响正常的细胞活动，最终损伤机体[30]。

在氧化应激的发生过程中，因AMP/ATP比值升高而激活的AMP活化的蛋白激酶，可以作为反映机体能量代谢水平的指标。由氧自由基与不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应产生的丙二醛，可以反映脂质过氧化程度。抗氧化系统清除自由基最重要的酶类——超氧化物歧化酶，是机体抗氧化能力的重要指标。这三者在相关文献中被作为观察指标及干预措施有效性检测指标[31-33]。

2.2中医分型CFS模型评价标准 在中医学中，CFS属于劳倦、懈怠、四肢不欲动等病症[34]，病位以肝、脾、肾居多，CFS的中医分型多围绕此三脏。目前，关于CFS的中医分型模型及评价标准研究较少，王宇航等[35]用一般情况、体重、行为学实验评价肾虚型CFS鼠类模型，其中一般情况及体重是肾虚的评价方式，力竭游泳与旷场实验为CFS的评价方式。冯玉华等[36]用饮食失调、疲劳过度、情绪失调的方法构建脾气虚CFS大鼠模型，用一般状态(包括精神状态、活动情况、饮食、大小便以及外观行为变化)和体重变化作为评价指标。在CFS中医分型的模型评价中，应充分体现“病证结合”的基本原则[37]，兼顾“病”与“证”的主要表现。在上述肾虚与脾气虚CFS鼠类模型中，对于“病证结合”的评价原则均有所体现，而对肾虚及脾气虚的主要表现的评价仍有待加强。

3 小 结

目前，以症状学为基础的CFS鼠类动物模型研究已取得长足进步，造模及评价方式基本还原CFS社会心理应激、长期疲劳等病因[38]。模型评价方式以行为学实验为主，将常用评价方式单独或组合应用，但在具体实验中尚存在如下问题：①所用评价方法不统一，对于不同的CFS造模实验，实验时间及实验强度均不同。但其评价仅以实验前后差异有无统计学意义为标准，无法对动物模型疲劳程度的“量”及是否患病的“质”做出区分，亦不利于不同干预水平的比较。②评价采用的实验方法往往只能体现身体或心理等单一层面疲劳问题，对于CFS这种多层面疾病，不能反映疾病的全貌。③客观评价指标相对较少。基于以上问题，建议在今后的模型建立及评价中，针对疾病不同状态、不同种类实验动物采用与之相应的、优化的、具有针对性的造模及评价方法，以利于进行不同干预措施的水平比较；为避免鼠类在评价方式下产生耐受，影响实验结果，造模方法与评价方法应尽量考虑动物的记忆与适应能力，且其评价方法应包含生理及心理应激原的双重检测；至于相关客观评价指标，则仍有赖于对CFS病因病机的进一步揭示。