昆虫抗菌肽抗炎活性及基于信号通路抗炎机制的研究进展

崔会程，夏嫱

炎症是机体对致炎因素引起损伤的一种防御性反应，轻微炎症可以提高机体免疫力，但长期慢性炎症会诱发多种疾病甚至癌症［1］。慢性炎症的发生和发展与人体内信号通路的活化关系密切。因此，阻断信号通路的激活，进而有效控制炎症的发生、发展一直是科学研究的热点。抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一类来源广泛、分子质量低及抗菌谱广的免疫活性物质［2］。昆虫抗菌肽不仅具有抗菌［3］、抗病毒［4］和抗肿瘤［5］等特性，亦能抑制炎性因子的过度表达，降低机体炎症程度，对于由炎症引起的疾病具有良好的治疗作用。本文对昆虫抗菌肽的抗炎活性及可能涉及的调节通路进行综述，以期为昆虫抗菌肽的应用研究提供参考。

1 昆虫抗菌肽抗炎活性

昆虫抗菌肽种类繁多，依据其来源、结构及功能的差异，分为天蚕素类昆虫抗菌肽、防御素类昆虫抗菌肽和富含特定氨基酸（如脯氨酸和甘氨酸）类昆虫抗菌肽［6］。目前，关于天蚕素类和防御素类昆虫抗菌肽的抗炎活性的研究较多，而关于富含特定氨基酸类抗菌肽抗炎活性的研究相对较少。

1.1 天蚕素类昆虫抗菌肽的抗炎活性 天蚕素类抗菌肽（cecropin-like antimicrobial peptides）因最早从惜古比天蚕（Hyalophora cecropia）蛹内分离得到而得名，一般由31～39个氨基酸残基组成，主要包括天蚕素（Cecropin）A、Papiliocin和Satanin，其优良的抗炎活性使其逐渐成为抗菌肽研究的热点。天蚕素A是天蚕素家族的主要成员。研究表明，天蚕素A不仅可以有效降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织内白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的水平，亦可以有效改善小鼠结肠组织的炎症反应［7］。Zhai等［8］研究发现，天蚕素A还可以显著降低大肠埃希菌（Escherichia coli）诱导的猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）内IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达。家蝇天蚕素（muscadomestica cecropin，MDC）也可有效降低伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）感染小鼠血清中干扰素（interferon，IFN）-γ、IL-6和IL-10的水平，抑制诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧合酶（cyclooxygenase，COX）-2 mRNA的表达［9］。Zhang等［10］将MDC与介孔碳纳米颗粒（mesoporous carbon nanoparticles，MCNs）构成的新型抗菌肽MDC@MCNs作用于溃疡性结肠炎小鼠后发现，MDC@MCNs亦能显著降低小鼠血清中IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平，从而改善小鼠结肠组织的炎症反应。燕尾蝶抗菌肽Papiliocin-3则通过抑制核转录因子（nuclear factor，NF）-κB和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的激活，减少脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）内IL-1β、IL-6和TNF-α的生成，进而发挥抗炎作用［11］。从蜣螂体内提取的2种天蚕素类抗菌肽Satanin-1和Satanin-2亦能显著降低LPS诱导的外周血单个核细胞的TNF-α表达水平，其优异的抗炎活性有望成为潜在的临床抗炎药物［12］。

1.2 防御素类昆虫抗菌肽的抗炎活性 防御素类抗菌肽（defensin-like antimicrobial peptides）最早由Masturyama从肉蝇（Phormia terranovae）体内提取分离而得，是由34～51个氨基酸组成的富含二硫键的阳离子多肽，主要包括防御素（Defensin）、防御素样肽（defensin-like peptides，DLP）、Protaetiamycine、Sapecin B和Coprisin等。从白星花金龟（Protaetia brevitarsis）体内分离的抗菌肽Protaetiamycine-6可以显著降低LPS诱导的小鼠小胶质细胞（BV-2）内IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，抑制iNOS和COX-2的mRNA表达［13］。Krishnan等［14］研究亦发现，基于白星花金龟抗菌肽Protaetiamycine设计合成的另一种抗菌肽Pro10-1D作用于感染性休克小鼠后，不仅可有效降低小鼠血清中IL-1β和TNF-α的表达水平，还可有效改善小鼠体内多器官损伤及全身性的炎症反应。从黑水虻（Hermetia illucens）体内提取的抗菌肽DLP4亦能降低猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）感染小鼠体内IL-6和TNF-α的表达水平［15］；而基于黑水虻抗菌肽DLP4衍生的另一种抗菌肽ID-13不仅可以有效降低金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染小鼠体内IL-6、IL-10和TNF-α的水平，且其毒性显著低于DLP4［16］。另外，来源于赤拟谷盗虫（Tribolium castaneum）的抗菌肽Defensin-1亦可以显著降低被卡他莫拉菌（Moraxella catarrhalis）感染的巨噬细胞的IL-1β和IL-8 mRNA表达水平［17］。基于褐尾麻蝇（Sarcophaga peregrina）抗菌肽Sapecin B衍生的抗菌肽KLK则通过抑制NF-κB信号通路的激活，减少RAW264.7炎性细胞内IL-1β和TNF-α的生成，抑制iNOS和COX-2 mRNA的表达［18］。蜣螂（Copris tripartitus）抗菌肽Coprisin则通过抑制RAW264.7炎性细胞内NO、TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1和MIP-2等的生成，进而抑制NF-κB和MAPK信号通路的传导［19］。

1.3 富含特定氨基酸类昆虫抗菌肽的抗炎活性 富含特定氨基酸类昆虫抗菌肽是因其序列中含有丰富的特定氨基酸而得名，主要包括富含脯氨酸类 抗 菌 肽（proline-rich antimicrobial peptides，PrAMP）和富含甘氨酸类抗菌肽（glycine-rich antimicrobial peptides，GrAMP）两类［6］。其中，富含脯氨酸类昆虫抗菌肽主要有蜜蜂肽（Apidaecin）、果蝇菌素（Drosocin）和凝集素（Lebocin）等；而富含甘氨酸类昆虫抗菌肽主要有攻击素（Attacins）、葛佬素（Gloverin）和Acaloleptin等。在研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin对大肠埃希菌K88感染小鼠的影响中发现，Apidaecin不仅可降低小鼠血清中IL-6、IL-10和TNF-α的水平，而且可以明显改善小鼠体内炎症反应［20］。基于Apidaecin衍生的抗菌肽Api137具有降低肺炎克雷伯杆菌感染细胞生成TNF-α的能力［21］。家蚕抗菌肽Bombyx mori gloverin A2（BMGlvA2）不仅可以降低肠产毒性大肠埃希菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）感染小鼠血清内IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，而且可以明显改善肠道因ETEC感染引起的炎症反应［22］。Lin等［23］研究亦发现，家蚕抗菌肽BMGlvA2能显著降低ETEC感染的IPEC-J2细胞生成IL-1β和TNF-α的能力。

2 昆虫抗菌肽抗炎机制

昆虫抗菌肽通过激活不同的信号通路，抵御外界病原微生物对机体的感染。在应对病原微生物感染时，昆虫抗菌肽主要通过Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）、NF-κB、MAPK、Janus激酶/信号转导子和转录活化子（janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phos-phatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt及转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β/Smad等信号通路发挥抗炎作用。目前，关于昆虫抗菌肽抗炎机制的研究主要集中在TLRs、NF-κB及MAPK这3条信号通路，而通过其他信号通路发挥抗炎作用的报道相对较少。

2.1 TLRs信号通路 TLRs是非特异性免疫应答中非常重要的Ⅰ型跨膜蛋白受体，能够识别入侵机体的细菌和病毒所释放的物质（如LPS、磷壁酸和肽聚糖等），进而调控炎症反应和获得性免疫，在免疫系统中发挥重要作用［24-25］。TLRs的发现使人类对于炎症发生的机制有了新的认识。在人类和其他哺乳动物体内参与免疫功能的TLRs受体分子有13种，即TLR1～13［26］。当外界异物进入机体后，被免疫细胞表面的TLRs家族识别，从而激活位于下游的信号通路，调节免疫细胞活性以及IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子的分泌，进而对机体的免疫系统进行调控。在研究蜣螂抗菌肽Coprisin对LPS诱导的炎症反应的影响中发现，Coprisin能显著抑制TLR4在RAW264.7细胞膜表面的表达，阻止LPS与TLR4的结合，进而抑制mTNF-α生成，发挥抗炎作用［19］。研究显示，人工合成的新型抗菌肽Pro10-1D亦可通过抑制RAW264.7炎性细胞表面TLR4的表达，达到阻止TLR4与LPS结合以降低IL-6和TNFα生成的目的［14］。西方蜜蜂（Apis mellifera）抗菌肽—蜂毒肽（Melittin）亦能通过抑制TLRs信号通路的激活，降低溃疡性结肠炎小鼠体内IL-6、TNF-α和COX-2的表达水平，从而发挥抗炎作用［27］。燕尾蝶抗菌肽Papiliocin则通过直接与TLR4和髓样分化蛋白（myeloid differentiation protein，MD）2复合物结合，抑制LPS与两者结合，进而降低TLRs信号通路的传导［28］。基于黑水虻抗菌肽DLP4衍生的抗菌肽ID13则通过抑制TLR2的表达，显著降低子宫内膜炎小鼠体内IL-6、IL-10和TNF-α的表达水平［29］。

2.2 NF-κB信号通路 NF-κB是负责调节先天性免疫应答和适应性免疫应答的转录因子，主要由NF-κB1（p50/105）、NF-κB2（p52/p100）、c-Rel、RelA（p65）和RelB组成［30］。在静息状态下，未活化的NF-κB与其抑制蛋白IκBα以复合物的形式存在于细胞质中，不具有调控转录功能；在外界刺激下，胞质中的IκB蛋白在其激酶IKK作用下被磷酸化和降解，NF-κB被释放、转运至细胞核内并与其靶基因结合，从而调控下游目标基因的表达及细胞因子的分泌［31］。Jantaruk等［18］研究发现，人工合成的新型抗菌肽KLK通过抑制p65亚基的核转移，阻断NF-κB信号通路的激活，进而降低RAW264.7炎性细胞生成IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2的能力。黄蜂抗菌肽Mastoparan X（MPX）则通过降低p65的磷酸化水平，阻断NF-κB信号通路的激活，进而降低败血症小鼠体内IL-2、IL-6、TNF-αmRNA的表达水平［32］。Zhao等［33］则发现，蜂毒肽可通过抑制p50亚基的核转移，进而抑制NF-κB信号通路的激活。另有研究显示，蜂毒肽亦可通过抑制IKK磷酸化，阻断NF-κB信号通路激活［34］。Liu等［35］合成的新型抗菌肽GNP-CK-CopA3可以通过阻断NF-κB信号通路激活，有效抑制LPS诱导的RAW264.7炎性细胞内ROS的生成以及iNOS、COX-2的蛋白表达水平，进而发挥抗炎作用。除此以外，从其他昆虫体内分离的 抗 菌 肽 如Psacotheasin-2［36］、Papiliocin-3［11］、Periplanetasin-5［37］以及Zophobacin-1［38］均可以通过抑制IκB的降解和磷酸化，从而降低LPS诱导的RAW264.7炎性细胞生成IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2的能力。

2.3 MAPK信号通路 MAPK广泛存在于多种真核生物细胞内，是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。目前已发现p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）、细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）3条信号转导 途径［39］。在未受刺激的细胞内，MAPK处于静止状态，而在外界刺激下，MAPK接收MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK激酶的激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）的活化信号而被激活，活化的MAPK进入细胞核内，进而调控下游基因的表达［40］。研究表明，燕尾蝶抗菌肽Papiliocin［28］和桑树黄星天牛（Psacothea hilaris）抗菌肽Psacotheasin-2［36］均能通过降低p38、ERK和JNK的磷酸化水平，抑制MAPK信号通路激活，进而调节细胞因子分泌的目的。燕尾蝶抗菌肽Papiliocin-3可通过阻断MAPK信号通路，抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2的生成［11］。美洲大蠊（Periplaneta americana）抗菌肽Periplanetasin-5通过抑制MAPK信号通路的激活，不仅可以有效降低RAW264.7炎性细胞生成IL-6和TNF-α的能力，还可以显著抑制iNOS和COX-2 mRNA的表达［37］。白星花金龟抗菌肽Protaetiamycine-6可以通过抑制RAW264.7炎性细胞内IL-1β、IL-6和TNF-α的表达，进而降低MAPK通路的信号传导［13］。人工合成的抗菌肽Pro10-1D可以通过抑制MAPK通路的激活，降低内毒素休克小鼠血清中IL-1β和TNF-α的表达水平，并改善小鼠肺部的炎症反应［14］。黄脸油葫芦（Teleogryllus emma）抗菌肽Teleogryllusine可通过抑制MAPK信号通路的激活，显著降低LPS诱导的BV-2细胞内TNF-α、iNOS和COX-2 mRNA的表达，且有望成为神经炎症治疗的潜力药物［41］。

2.4 JAK/STAT信号通路 JAK/STAT信号通路主要由接收信号的酪氨酸激酶受体、传递信号的酪氨酸激酶JAK及信号转导和转录激活因子STAT组成。JAK是一类非受体酪氨酸激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3和酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TYK）2。STAT家族由7种不同类型的信号转导和转录激活因子组成，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6［42］。未激活的JAK和STAT主要位于细胞质内，在外界刺激下细胞因子或生长因子与受体结合后诱导JAK磷酸化，招募并磷酸化STAT，使其以二聚体的形式穿过核膜进入核内，参与调节靶基因的表达［43］。在研究蜂毒肽对TNF-α和IFN-γ诱导的人永生化角质形成细胞（HaCaT）的影响中发现，1 mg/L蜂毒肽就可显著降低HaCaT细胞内JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化水平，进而降低IL-1β、IL-6和IFN-γ的生成［44］。蜂毒肽还可以通过降低STAT3的磷酸化水平，阻断JAK/STAT信号通路激活，进而降低胆管炎小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平，改善小鼠肝脏的炎症反应［45］。蜣螂抗菌肽CopA3也可以通过降低STAT1和STAT5的磷酸化水平，进而抑制JAK/STAT信号通路的激活，降低RAW264.7炎性细胞生成IL-6和TNF-α的能力［46］。基于蜣螂抗菌肽CopA3衍生的另一种抗菌肽CopA5可以通过抑制RAW264.7炎性细胞内NO和TNF-α的生成，从而降低JAK/STAT信号通路的信号传导［47］。

2.5 PI3K/Akt信号通路 PI3K/Akt信号通路是通过丝氨酸或苏氨酸磷酸化介导的信号通路，以关键蛋白PI3K和Akt命名。PI3K依据结构和功能的差异分为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类；Akt是一种丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶，存在Akt1、Akt2、Akt3这3种高度关联的亚型［48］。在外界刺激下，活化的受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）通过募集衔接蛋白激活PI3K，激活的PI3K将4，5-磷脂酰肌醇转化为3，4，5-磷 脂 酰 肌 醇（phosphatidylinositol-3，4，5-bisphosphate，PIP3），PIP3则通过招募3-磷酸肌醇依赖 性 激 酶（3-phosphoinositide-dependent kinase，PDK）1和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTORC）2而诱导Akt发生磷酸化，进而参与调节下游靶基因的表达［49］。研究表明，蜂毒肽不但可以降低被牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）感染的HaCaT细胞内Akt的磷酸化水平，还可以抑制细胞内IL-6、IL-8和TNF-α分泌，进而降低PI3K/Akt信号通路的信号传导能力［50］。蜂毒肽还通过降低胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）-1诱导的人皮脂腺细胞（SZ95）内PI3K和Akt磷酸化水平，抑制PI3K/Akt信号通路的激活，进而降低SZ95细胞内IL-6、IL-8、IFN-γ和TNF-α的生成［51］；蜂毒肽亦可以通过降低巨噬细胞内Akt的磷酸化水平，进而抑制PI3K/Akt信号通路的激活，减少IL-1β和TNF-α生成［52］。Moon等［53］研究亦发现，蜂毒肽通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活，从而降低BV-2炎性细胞内IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，抑制iNOS和COX-2 mRNA的表达，进而发挥抗炎作用。

2.6 TGF-β/Smad信号通路 TGF-β/Smad信号通路主要通过TGF-β家族及其下游的效应转录分子Smad发挥免疫调控作用。TGF-β家族主要包括TGF-β、TGF-β受 体 和 骨 形 成 蛋 白（bone morphogenic proteins，BMP）等。Smad依据功能差异分为受体调控型Smad（receptor-regulated Smad，RSmad）、通 用 型Smad（common partner Smad，Co-Smad）和抑制型Smad（inhibitory Smad，I-Smad）［54］。在外界刺激下，TGF-β家族配体与Ⅱ型受体结合后招募并磷酸化Ⅰ型受体，Ⅰ型受体再磷酸化RSmad，进而诱导其与Co-Smad结合，形成R-Smad/Co-Smad复合物后在细胞核内聚集，再与靶基因结合达到调控目标基因表达的目的［55］。研究发现，蜂毒肽可以通过抑制TGF-β/Smad信号通路的激活，降低胆管炎小鼠体内IL-6和TNF-α的水平，进而达到改善小鼠体内炎症反应的目的［45］。蜂毒肽还可以通过降低TGF-β/Smad信号通路的传导，抑制真菌诱导的成纤维细胞发生纤维化，其有望成为呼吸道炎症治疗的潜力药物［56］。蜣螂抗菌肽Coprisin通过降低TGF-β/Smad信号通路的信号传导，降低大鼠伤口感染的发生率并促进伤口愈合［57］。

3 昆虫抗菌肽药物临床研究现状

自抗菌肽被发现以来，因其抗菌谱广且不易产生耐药性，从而备受研究者青睐，有望成为抗生素的替代品［6］。截止2020年1月，已有7种抗菌肽通过美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准进入临床应用［58］。虽然昆虫抗菌肽是世界上第一个被发现的抗菌肽，但其还尚未正式在医药领域广泛应用，主要是目前还存在对昆虫抗菌肽某些不良反应的担忧。（1）昆虫抗菌肽是否会引起机体的过敏反应？目前鲜见昆虫抗菌肽会引起过敏反应的报道。仅Carpena等［59］报道，蜂毒不仅具有明显的毒性，而且容易产生严重的过敏反应。然而，蜂毒肽仅是蜂毒的一部分，过敏反应是否由蜂毒肽引起还尚未确定。（2）某些昆虫抗菌肽的毒性亦限制了其在医药领域的应用。Askari等［60］研究发现，蜂毒肽在低浓度时无毒性但抑菌效果差，在高浓度时抑菌效果较好，但是具有明显的毒性。（3）昆虫抗菌肽抗炎机制研究尚处于初始阶段。目前仅确定昆虫抗菌肽可以通过信号通路发挥免疫调控作用，但相同或不同来源的昆虫抗菌肽是否通过相同或不同的机制发挥作用尚未清楚，这亦是今后昆虫抗菌肽研究的热点问题。

4 小结

昆虫抗菌肽在抗炎方面具有良好的开发潜力和研究价值，但是由于天然抗菌肽产量低，使其药代动力学研究受限，进而影响其临床研究的开展。通过化学合成手段虽然能够提高其产量，但是获得的抗菌肽毒性过高，不利于研究的深入开展。目前，科研人员不仅利用基因工程、蛋白质工程等手段提高昆虫抗菌肽产量，还通过对抗菌肽结构进行修饰来提高其生物活性，进而满足应用研究的需要［61］。随着抗菌肽上述问题的攻克，昆虫抗菌肽的抗炎活性有望得到有效开发，在临床抗炎药物研发方面亦会取得更大突破。