不同方法制备羊肚菌母种的效果比较

周 帅 陈鑫伟 郑东方 韩 彬

不同方法制备羊肚菌母种的效果比较

周 帅 陈鑫伟 郑东方 韩 彬

（商丘市农林科学院，河南 商丘 476000）

为明确不同制备方法对羊肚菌母种质量的影响，以羊肚菌干子实体与鲜子实体为材料进行组织分离制备母种，比较其各项活力指标，结果为：干子实体组织分离的菌种萌发率、长满试管和产核的平均时间均优于鲜子实体组织分离；对比不同转管方式母种的菌丝生长和产菌核情况的结果显示：采用放置一年母种和当年分离母种混合转接，可显著提高二级母种的活性，增加成活率，菌丝满管和产菌核时间提前。综合得出较佳的羊肚菌母种制备方法是：采用干子实体组织分离获得母种，再用放置一年的母种与当年分离母种混合转接制备二级母种。

羊肚菌；子实体；组织分离；母种优化制备

羊肚菌（spp.）菌盖表面凹凸似网状，像花生外壳又似羊肚，故得名羊肚菌，是世界珍稀食用菌之一。其味道鲜美、营养丰富，含有8种维生素和18种氨基酸[1]，有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾壮阳、健脑提神、增强人体免疫力等功效。野生采集产量稀少，历史上曾奉为“皇家贡品”。

四川省林业科学院于2003年发明的羊肚菌外营养袋技术，极大地提高了羊肚菌人工栽培的可重复性及产量[2]。此后，我国羊肚菌人工栽培迅速发展，产量和品质不断提高。但受限于种性原因等，羊肚菌栽培技术仍不完善，产量易受气候、菌种、管理等多种因素影响而不稳定。因而，亟待对羊肚菌开展反季栽培及工厂化周年栽培研究攻关，降低其种植风险，提高种植稳定性和效益。

羊肚菌属子囊菌，菌种退化速度快，需要经常制种[3]。菌种质量直接影响羊肚菌的产量和品质，关系到菇农的切身利益。为提高羊肚菌母种制备质量，开展不同方法制备羊肚菌母种的效果比较试验，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试羊肚菌品种为六妹羊肚菌，鲜子实体从田间选取菌肉肥厚、大小适中、颜色正常、无病虫害、长至6～8分成熟的优质菇。干子实体选择在阳光下晒干或自然风干，或为晒干、风干后保藏的无发潮、无霉变的子实体。不可选用烘干的子实体。干羊肚菌组织分离成功的关键在于选择干净无污染、无霉变、洁白或微黄的子实体，以及从鲜品到干品的处理过程无机械压伤和化学污染等[4]。

PDA培养基配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，硫酸镁2 g，琼脂20 g，蛋白胨0.5 g，牛肉膏0.5 g，水1000 mL，pH自然。

1.2 不同子实体组织分离比较试验

（1）培养基试管制作。马铃薯去皮、切块，置于1000 mL水中文火煎煮约30 min，煮好后用纱布过滤取汁。将琼脂、葡萄糖、硫酸镁、蛋白胨、牛肉膏加入滤汁中，加热至全部溶化，用量杯测量是否达到 1000 mL，如不足，则用开水补足。然后把混合液用长管漏斗分装入试管中，加至试管1/3高度后，用消毒棉花塞紧试管口。培养基不可沾到试管口，以免污染棉塞滋生杂菌。装好的试管120～125 ℃、0.1 MPa高压灭菌30 min。待压力锅压力降至0后，取出试管趁热斜放，倾斜度以培养基离试管口约1/3试管长度为佳。冷却凝固后，取少量试管于25～30℃恒温箱中放置5天，经观察确认无杂菌后，才能大量用于分离制种或转接生产母种。

（2）组织分离方法。组织分离须在严格的无菌条件下进行，用略干的酒精棉球将子囊果菌柄、菌盖擦拭干净，擦拭过程及时更换酒精棉球。在超净工作台中，用75%的酒精消毒双手，先用酒精对镊子、剪刀等接种用具消毒，再用酒精棉擦试，然后放到酒精灯火焰上烧一下。剪开羊肚菌，剪取与菌盖交接处的菌柄部分，切取2～5 mm大小组织块，用镊子夹住放入试管，塞好棉塞后置于20～24 ℃恒温箱避光培养。

干、鲜子实体组织分离处理各设置3个重复，每重复10支试管。观察记录两种分离方法的菌丝长势、色泽、密度、形态及生长速度，判别菌丝体活性强弱。

1.3 母种优化制备

试验设当年分离母种（组织分离后，于20～24 ℃恒温箱避光培养15天左右的母种）、放置一年母种，以及当年分离母种与放置一年母种混合后母种等3个转管处理。其中，混合后接种的培养方法为将两种母种各取一部分放在一起，转接到同一试管内。每处理设置3个重复，每重复10支试管。观察记录各处理菌丝长势、色泽、密度、形态及生长速度，判别菌丝体活性强弱。

2 结果与分析

2.1 不同组织分离母种的菌丝生长和产菌核情况

萌发率是指接种的羊肚菌组织能完好萌发的概率[4]。本试验干子实体组织分离的3个重复分别萌发9支、8支和10支试管，平均萌发率为90%；鲜子实体组织分离的3个重复分别萌发9支、8支和8支，平均萌发率为83.3%。干子实体分离的菌丝萌发较慢，平均需要2.67天，但生长速度较快，满管时间平均为6.67天，显著快于鲜子实体分离的7.32天，且表现生长浓密、长势旺盛，菌丝呈白色、毡绒状。鲜子实体分离的菌丝萌发较快，平均为2.32天，但生长速度较慢，满管时间平均需7.32天，表现生长较密，菌丝呈白色、绒絮状，长势略逊于干子实体分离法。

从产菌核情况看，以干子实体分离法的数量较多，菌核呈点状，前期为白色、后期变黄褐色，密集分布在接种块周围；产菌核时间快，平均9.26天，显著快于鲜子实体分离的平均10.12天。鲜子实体分离法产菌核数量较少，为片状，前期为白色、后期变黄色，密集分布在试管边缘。

2.2 不同转管母种的菌丝生长和产菌核情况

由表1可知，当年分离母种转管处理的平均萌发率为86.7%；放置一年母种转管处理的平均萌发率为83.3%；混合母种转管处理的平均萌发率达93.3%，显著高于前两种转管方法。

表1 不同方法制备的母种转管后菌丝生长情况

转管方法长势颜色密度形态萌发时间/d满管时间/d平均萌发率/% 当年分离+++白较密毡绒状2.54±0.3 b7.19±0.5 b86.7 b 放置一年++黄白疏密绒蕠状2.56±0.3 b7.56±0.5 b83.3 b 混合后+++++白浓密毡绒状1.96±0.3 a6.17±0.5 a93.3 a

注：“+”越多表示菌丝长势越好；数据为3个重复平均值。同列数据后小写字母不同表示差异显著（＜0.05）；表2同。

当年分离母种转管处理与放置一年母种转管处理之间的菌丝平均萌发时间和平均满管时间的差异均不显著，而混合后转管处理的菌丝萌发和满管时间明显增快，差异达显著水平。

由表2可知，混合母种转管处理的产菌核数量多，产核时间快，平均为8.46天，较当年分离母种转管处理快近1天，较放置一年母种转管处理快近2天，菌种活性更强，差异达显著水平。

3 结论与讨论

选择适宜的干子实体为分离材料制备羊肚菌母种，较鲜子实体组织分离法的萌发率高，且菌丝生长浓密，长势旺盛，平均满管时间和平均产核时间分别为6.67天和9.26天，短于鲜子实体分离法的7.32天和10.12天。总体来说，干子实体组织分离法生产出的羊肚菌母种各项指标均略优于鲜子实体分离法。

表2 不同方法制备的母种转管培养中菌核的形成情况

母种转管方法分布数量形态后期颜色产核时间/d 当年分离接种块周围密集分布***点状黄 9.38±0.5 b 放置一年试管边缘密集分布**片状黄褐10.40±0.5 b 混合后试管内均匀密集分布****簇生微黄 8.46±0.5 a

注：“*”越多表示菌核数量越多；数据为 3 个重复平均值；菌核前期均呈白色。

采用当年分离母种与放置一年母种混合后进行转管，不仅萌发率高于两种母种单独转管，二级母种的萌发时间和菌丝满管时间显著加快，而且产菌核数量多、时间短，平均产核时间分别较当年分离母种转管处理和放置一年母种转管处理快近1天和近2天，其菌种活性更强。

由于羊肚菌种植受气候条件、菌种、菌丝生长阶段和出菇阶段管理措施等各种因素影响较大，是一项高投资、高技术、高风险的“三高”产业，产量极不稳定，重复性差。因此，研究提高羊肚菌种植各环节的技术水平对整个行业的发展都具有重要意义。本试验通过对比分析，得出结论：采用干子实体组织分离法制备羊肚菌母种，并将放置一年母种同当年分离母种混合转接，可以显著提高二级母种活性和成活率，使菌种提前长满试管及产生菌核，是羊肚菌母种生产中的较为理想的方法。

[1] 裘源春. 羊肚菌高效栽培技术[M]. 北京: 中国农业技术出版社, 2018.

[2] 谭方河. 阐释我国羊肚菌外营养袋栽培技术的发展历程[J]. 食药用菌, 2019, 27(4): 257-263.

[3] 刘伟, 张亚, 蔡英丽. 我国羊肚菌产业发展的现状及趋势[J]. 食药用菌, 2017, 25(2): 77-83.

[4] 黎智文, 代俊杰, 李晓. 羊肚菌干子实体组织分离与孢子分离获得菌种的比较试验[J]. 食药用菌, 2018, 26(2): 94-95.

Comparative study on tissue isolation from dried and fresh fruiting bodies of

Zhou Shuai Chen Xinwei Zheng Dongfang Han Bin

（Shangqiu Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Shangqiu, Henan 476000, China）

In order to clarify the influence of different preparation methods on the quality ofmother culture, the dried fruiting body and fresh fruiting body ofwere used as materials for tissue separation to prepare mother culture, and the vitality indexes of the strains were compared. The results were as follows: from the perspective of the germination rate, the average time of mycelium filling test tube and sclerotia production, mother culture isolated from dry fruiting body tissue were better than that of isolated from fresh fruiting body tissue. The results of comparing the mycelial growth and sclerotium production of mother culture with different tube transfer methods showed that the mixed transfer of mother culture stored for one year and isolated currently could significantly improve the activity of secondary mother culture, increase the survival rate, and advance the time of mycelial full tube and sclerotium production.

; fruiting body; tissue isolation; optimized preparation of mother culture

S646

B

2095-0934（2022）02-148-03

周帅（1979—），男，河南商丘人，本科，助理研究员，主要从事食用菌研究及高产新品示范工作。E-mail：372388688@qq.com。