嘌呤P2X7受体在视网膜变性类疾病中的作用研究进展△

祁玉麟 叶河江

视网膜变性类疾病[如视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变(DR)等]、青光眼等眼病共同的病理改变为感光细胞、神经节细胞等视网膜神经元细胞的损伤和变性凋亡[1-2]。目前，三磷酸腺苷(ATP)及嘌呤能离子通道型7(P2X7)受体在神经性疼痛、阿尔茨海默病、帕金森病、脊髓损伤及多发性硬化等神经退行性疾病中发挥重要作用而成为研究的焦点[3-6]，P2X7受体介导的信号异常表达或激活与神经退行性及炎症疾病的病变过程相关。视网膜作为中枢神经系统向外延伸的一部分，P2X7受体在视网膜多种类型的细胞中表达，ATP通过对P2X7受体的作用来调节视网膜中一系列细胞功能。P2X7受体功能异常可能导致青光眼和遗传性视网膜退化中神经元细胞丧失，以及AMD和DR视网膜的炎症反应[7-9]，而调控P2X7受体功能可能在防止视网膜神经元丧失、减轻与视网膜疾病相关的炎症或改变免疫细胞吞噬作用等方面发挥作用。本文对近年来嘌呤P2X7受体在视网膜变性类疾病中的作用进行综述。

1 P2X7受体的结构及功能

ATP及其降解产物是体内重要的信息传递分子，在应激状态下细胞内高浓度的ATP被释放到胞外环境中，作用于配体门控离子通道(P2X1-7)受体[10]和代谢型G蛋白连接的嘌呤能受体(P2Y12,4,6,11-14)[11]。作为P2嘌呤家族受体的成员之一，P2X7受体由595个氨基酸残基组成，具有两个跨膜结构、一个胞外结构域，胞内由N端和C端组成[12]，C端区在P2X受体家族中最长，与其他蛋白无同源性，带有蛋白质和脂质的结合基序，此特殊结构使P2X7受体具有独特的分子功能，能通过扩展N端的胞质尾区引起质膜渗透障碍，导致细胞毒性及凋亡[13]。P2X7受体是P2X受体家族的最后一个成员，与嘌呤家族其他配体门控离子通道不同，其独特之处在于：首先，P2X7受体是对ATP敏感性最低的亚型，相较于其他P2X受体需要更高浓度的ATP来激活，其可根据ATP激活的浓度和持续时间来介导不同的功能[14]；其次，P2X7是唯一不仅可渗透小分子阳离子，还可以通过应用激动剂暂时打开渗透无机大分子的亚型。P2X7受体的最初激活可导致非选择性胞膜孔道的开放，允许Na+、Ca2+内流和K+外流，对Ca2+具有显著的渗透性[15]。在低二价阳离子或持续性刺激活化则可导致跨膜孔道的形成，可通过相对分子质量低于900的亲水性分子参与相应的病理生理过程[16-17]。

2 P2X7受体在视网膜中的分布

细胞中ATP代谢介导视网膜的病理过程，在视网膜中也检测到几种P2受体的表达[18]。研究显示，P2X7受体可在视网膜多种类型的细胞中表达，包括神经元细胞、胶质细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞和血管细胞[4,8]。在成年鼠视网膜的内核层和神经节细胞层的许多细胞上均可检测到免疫标记的P2X7受体，也发现其存在于视杆及双极细胞中[8]。视网膜神经元包括感光细胞、神经节细胞(RGC)和腺分泌细胞，它们均表达P2X7受体[8]。有研究者通过应用P2X7激动剂BzATP[19]或敲除小鼠基因[8]进一步证明了P2X7受体在感光细胞中的表达及作用。

除了在神经元细胞表达外，P2X7受体在视网膜胶质细胞中也有表达。视网膜胶质细胞对维持视网膜稳态至关重要，在疾病过程中具有关键作用。研究表明，视网膜Müller细胞、小胶质细胞中也表达P2X7受体[8,20-21]，激活P2X7受体可调节视网膜Müller细胞胶质增生改变和功能障碍。同样，P2X7受体激动剂可增加视网膜小胶质细胞激活及释放白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)损伤视网膜细胞。在病理条件下，P2X7受体的表达上调使视网膜神经元易于受损，因此靶向 P2X7 受体可作为治疗视网膜疾病的手段[22]。

3 P2X7受体在视网膜变性类疾病中的作用

3.1 P2X7受体介导视网膜神经元细胞的损伤及凋亡

3.1.1 感光细胞感光细胞包含视锥细胞和视杆细胞，二者感知并传递光刺激，在视觉信号转导通路中具有重要作用。视网膜嘌呤能信号异常可能会影响感光细胞的完整性和功能。ATP是P2X7受体的内源性激动剂[23]，在正常生理条件下,细胞外二价阳离子浓度和细胞外低浓度的ATP维持低水平的P2X7受体活性[24]。P2X7受体在低浓度ATP中不激活，而应激状态下RPE细胞和视网膜神经细胞均可释放大量ATP激活RPE细胞及感光细胞上的P2X7受体[24-25]。一项体外研究发现，加入P2X7受体激动剂BzATP后视网膜感光细胞出现死亡率的增加[19]，伴随Caspase-8/-9的激活和促凋亡因子的形成及转移。同样在动物实验中，于啮齿动物或猫的玻璃体内注射高浓度ATP导致其视网膜感光细胞快速及持续性丢失[26-27]。

感光细胞表达P2X7受体，P2X7受体激活介导了感光细胞凋亡，而敲除P2X7受体或采用P2X7拮抗剂治疗则抑制其视网膜感光细胞的死亡[19]。在RP小鼠模型感光细胞变性期间，视网膜中P2X7受体mRNA表达上调[28]。玻璃体内注射ATP导致大鼠视网膜中感光细胞的持续凋亡，而使用P2X7受体拮抗剂则明显减少感光细胞凋亡。在RP模型rd1小鼠中使用嘌呤能拮抗剂吡哆醛衍生物(PPADS)可减少约30%的感光细胞死亡[26]。同样，渗出型AMD中感光细胞丢失伴随视网膜下出血，在视网膜下出血小鼠模型中采用P2X7受体拮抗剂Brilliant Blue G(BBG)治疗可起到保护作用，阻止晚期AMD视网膜下出血引起的感光细胞死亡[29]。这些研究结果表明，P2X7受体在感光细胞死亡中的作用及其受体拮抗剂可能具有一定的保护作用。

3.1.2 RPE细胞RPE细胞在视网膜外层形成血-视网膜屏障，其向内紧邻视网膜光感受器的外段，为相邻的光感受器提供多种支持功能，向外则与脉络膜供血相邻[30]。RPE细胞损伤是AMD病理改变的始动环节。研究表明，P2X7受体参与AMD氧化应激、炎症反应等过程，P2X7受体激活引起Ca2+稳态失常也是AMD形成的可能原因[31]。也有研究指出，老年P2X7受体敲除小鼠表现出受体活性的改变以及早期AMD的特征[9]。当组织受到炎症、损伤、感染等刺激时会引起细胞外的ATP释放增加，P2X7受体激活膜孔形成导致Ca2+内流，RPE细胞凋亡；同时，激活P2X7受体，释放ROS刺激慢性氧化应激发生，促使RPE细胞老化导致AMD发生。也有研究表明，P2X7受体介导的NLRP3炎症小体激活引起RPE细胞死亡和地图样萎缩，参与干性AMD的发生[32]。此外，在ABCA4-/-RP小鼠模型中，激活P2X7受体导致RPE细胞通过涉及Ca2+流入的过程释放IL-6，在细胞外高ATP浓度条件下增加RPE细胞中的炎症或保护性信号传导，而使用P2X7R拮抗剂 A438079、A839977及AZ10606120 则抑制IL-6的释放[33]。因此，阻断P2X7受体的激活可能对RPE细胞的功能起到保护作用。

3.1.3 RGC细胞外ATP浓度改变和P2X7受体激活可导致RGCs的病理性丧失和视网膜功能障碍[34-37]。在DR模型鼠中Müller细胞释放ATP通过激活小胶质细胞上P2X7受体及其随后炎症细胞因子的表达，进而诱导RGCs凋亡[38]。RGCs损伤死亡也与青光眼患者视力丧失密切相关，有研究指出ATP诱导的P2X7受体活化是青光眼的发病机制[39]，ATP水平伴随眼压的增加而上升，进而激活RGCs上P2X7受体表达对RGCs产生有害作用[4]。P2X7受体介导缺氧或高眼压诱导的RGCs死亡[7,40]，其活化后可促进IL-18和IL-6等炎症因子的释放参与RGCs死亡，而RGCs的死亡可伴随眼压增高，进而加剧P2X7受体的活化，导致炎症因子表达上调，加速RGCs的死亡[37]。P2X7受体的激活增加可能与其他因素一起导致视网膜功能的变化和 RGCs的死亡[40]。此外，P2X7受体的异常激活通过依赖于细胞内Ca2+浓度增加的方式导致RGCs死亡[34]，对年龄相关性青光眼神经变性的遗传小鼠(DBA/2J小鼠)模型采用P2X7受体拮抗剂治疗，可显著改善PERG信号，同时降低视网膜小胶质细胞激活，对RGCs具有神经保护作用[41]。通过P2X7受体阻断或基因敲除可延迟细胞死亡和减少吞噬小胶质细胞的增加，保护RGCs免受视神经的挤压，因此阻断P2X7受体激活对RGCs具有神经保护作用。

3.2 P2X7受体调控视网膜胶质细胞的作用

3.2.1 小胶质细胞小胶质细胞作为眼内主要的固有免疫细胞，其过度激活促进神经毒性因子的释放，如TNF-α、IL-1β、氧和氮自由基以及 Fas-配体，从而导致神经元和感光细胞变性凋亡。Vessey等[8]在小鼠视网膜中发现小胶质细胞表达P2X7受体，Gu等[25]也在灵长类动物眼的小胶质细胞上检测到P2X4和P2X7受体表达，两种受体一旦被激活可能会导致先天吞噬作用的丧失并使个体易患AMD。在小鼠激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)模型中，小胶质细胞累积激活并表达嘌呤能受体P2X4、P2X7、P2Y2和 P2Y12，运用P2受体抑制剂可以显著影响小胶质细胞的功能，抑制CNV的形成[21]。P2X7受体是ATP刺激视网膜小胶质细胞活化并分泌促炎细胞因子的关键，P2X7受体介导NLPR3信号通路调控视网膜小胶质细胞的活化增殖，促使其产生并释放一些促炎细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，导致RGCs损伤及凋亡[42]。

3.2.2 星形胶质细胞P2X7受体除了在胶质细胞激活中发挥作用外，还可增加星形胶质细胞中炎症因子的启动。视神经盘中星形胶质细胞通过Pannexin半通道释放机械敏感性ATP，导致P2X7受体激活并通过NF-κB途径引发炎症信号[43]。P2X7 受体参与视网膜中星形胶质细胞IL-6机械敏感性的上调和释放，P2X7拮抗剂则可阻止星形胶质细胞肿胀诱导的IL-6表达升高[44]。在慢性青光眼Tg-MYOC(Y437H)小鼠模型中，响应于升高的眼压，通过上调星形胶质细胞中的Pannexins半通道引起ATP 释放，激活P2X7受体，增加视网膜细胞的死亡[45]

3.2.3 Müller细胞Müller细胞是视网膜上ATP的重要来源，其释放的ATP是维持视网膜中水动力的关键，而阻止这种释放会导致视网膜肿胀和水肿[20]。有研究表明，谷氨酸可以通过激活Müller细胞上的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)及非NMDA受体导致ATP的释放[46]。P2X7受体激活促使Müller细胞去极化，从而降低谷氨酸摄取率，导致细胞外谷氨酸水平升高，降低细胞外渗透压和神经元衍生的渗透剂的摄取，进而引起Müller细胞肿胀和视网膜水肿。在大鼠玻璃体内注射I 型代谢型谷氨酸受体激动剂(S)-3,5-二羟基苯基甘氨酸(DHPG)诱导Müller细胞激活增生，导致ATP 释放增加[47]，可以通过上调P2X7受体表达导致RGC-5细胞的凋亡，增强ATP的有害作用，而加入P2X7受体阻断剂后可以抑制Müller细胞激活，减少RGC的凋亡[48-49]。

3.3 P2X7受体调控视网膜炎症反应P2X7受体参与多种关键细胞因子分泌和介导炎症反应[50]。作为炎症反应中重要的参与者，炎症因子在视网膜中异常聚集可能损伤血管内皮细胞，造成组织水肿、渗漏及无灌注区的形成。此外，炎症反应能够降解血-视网膜屏障的完整性，进而导致视网膜血管阻塞和局部缺血[51]。P2X7受体的激活诱导Ca2+流入，促使NLRP3炎症小体激活和IL-1β、IL-18的加速释放，导致视网膜炎症反应和损伤[52]。研究表明DR复杂病理情况与病变部位炎症因子的持续活化有关[53]。在DR模型中，P2X7受体激活调节细胞因子的过度表达和释放，诱导炎症反应，破坏血-视网膜屏障的完整性，加重视网膜内皮细胞的损伤[54]。P2X7受体又可通过细胞内Ca2+水平介导周细胞的收缩，激活P2X7受体导致体外DR大鼠视网膜毛细血管周细胞释放炎症因子并促进炎症反应，导致周细胞死亡，从而损害血-视网膜屏障的完整性，导致血管渗漏和黄斑水肿[55]。使用P2X7受体拮抗剂OxATP可以明显减轻P2X7受体激动剂BzATP对视网膜毛细血管周细胞的毒性作用，提高细胞存活率[56]。

3.4 P2X7受体影响新生血管生成血管内皮生长因子(VEGF)是视网膜血管损伤发生和进展的核心因素，参与DR、AMD等许多视网膜疾病的发病机制。P2X7受体激活或过表达促进VEGF的分泌和累积，从而促进疾病过程中新生血管的生成。ATP 水平升高可能会促进内皮细胞和先天性免疫细胞中 P2X7受体介导的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)活化，反过来又会促进VEGF释放和血管异常增殖[57]。VEGFA是DR的靶点和生物标志物，P2X7受体激动剂BzATP增加了体外视网膜内皮细胞中VEGFA mRNA的表达[58]。此外，P2X7受体激活引起NLRP3过度表达，在转基因Akimba高血糖小鼠中NLRP3激活失调导致血管渗漏和视网膜新生血管形成[59]。而在STZ诱导的大鼠高血糖性视网膜病变模型中P2X7受体表达增加，运用两种不同的P2X7受体拮抗剂A740003或AZ10606120靶向抑制P2X7受体可有效降低血管通透性，减少VEGF和IL-6的释放[60]。这些研究结果表明，靶向P2X7受体可能是抑制VEGF释放的有效途径。

4 P2X7受体调控神经元细胞损伤相关机制通路

有研究表明P2X7受体的激活诱导许多细胞信号通路[61]。细胞外ATP和P2X7受体相结合产生寡聚化反应，打开离子通道或膜孔后K+外流，这一变化激活重要的核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体[62]。NRLP3炎症小体的激活可增强炎症及视网膜疾病中细胞死亡。NRLP3炎症小体的激活与Caspase-1的裂解和促炎细胞因子IL-1β、IL-18的释放有关。在CNV小鼠模型中，视网膜小胶质细胞激活并通过P2X7/NLRP3/Caspase-1炎症小体通路参与CNV生成[63]。P2X7受体可以辅助NLRP3精确聚焦K+流出和Ca2+流入的位置，通过调节NLRP3的表达水平来放大促炎信号[64]。有研究指出P2X7R/NLRP3信号通路可影响视网膜组织导致DR的发生和进展[65]。高糖条件下诱导组织缺血缺氧，可激活RPE细胞上P2X7受体,从而活化NLRP3炎性复合体,使其释放炎性介质发挥生物学作用[66]，通过下调DR小鼠视网膜中P2X7R/NLRP3通路蛋白表达可保护视网膜细胞[67]。此外，阻断P2X7受体通过调控NLRP3及NF-κB信号通路可降低Caspase-1的表达，抑制ROS生成以及HIF-1α和VEGF表达来减轻视网膜炎症和抑制新生血管形成，保护视网膜功能[68]；阻断P2X7/NLRP3/Caspase-1信号及抑制下游IL-1β表达可减缓眼底玻璃疣沉积物现象，促进AMD小鼠视网膜结构恢复[69]。

此外，P2X7受体可激活小胶质细胞导致释放溶酶体蛋白酶组织蛋白酶S释放，进而促进神经元趋化因子CX3CL1/CX3CR1的参与并反馈给小胶质细胞，在神经元损伤性信号转导中起关键作用[70]。P2X7R/CX3CL1/CX3CR1信号通路激活小胶质细胞，导致细胞内p38 MAPK蛋白磷酸化，随后刺激释放IL-6和IL-1β损伤神经元细胞[71-72]，介导神经元-小胶质细胞的相互作用。NMDA受体激活后大量 Ca2+内流被认为是视网膜神经元细胞死亡的一种机制，P2X7 受体的激活参与了 NMDA受体介导的体内大鼠视网膜组织损害和RGCs死亡。使用P2X7受体拮抗剂A438079、BBG防止NMDA诱导的SD大鼠视网膜损伤和抑制胶质细胞对谷氨酸的摄取[73]。

5 小结

视网膜变性类疾病是严重致盲性眼病，感光细胞凋亡和视网膜神经元进行性退化会引起不可逆的视网膜损伤，然而目前尚无有效的治疗方法。P2X7受体被认为是多种眼部疾病的潜在药理学靶点，P2X7受体激活与视网膜神经元及胶质细胞的关系成为研究热点，靶向P2X7受体的治疗可发挥保护视网膜组织功能及神经元细胞的作用。目前，运用P2X7受体拮抗剂(如A438079、A839977、BBG和MRS 2540等)可防止视网膜神经元细胞的损伤和凋亡[43-44,73-75]，其中BBG 也是眼科手术中的一种获批佐剂药物。阻断P2X7受体及其介导的相关信号通路能够抑制胶质细胞激活，保护视网膜神经元细胞，促使P2X7受体有望成为治疗视网膜变性类疾病的一个重要新靶点。目前已经开发出高选择性小分子P2X7受体抑制剂，部分已被用于一些慢性炎症疾病的 I期和II期临床研究中测试并评估[76]。但是，P2X7受体与视网膜神经元及胶质细胞的关系仍需要进一步的基础研究及临床试验进行探索，对于全面认识P2X7受体并验证其保护视网膜变性类疾病的作用及机制具有重要的意义。