一起保育仔猪副猪嗜血杆菌病的诊治

周忠华

（山东省莱阳市动物疫病预防控制中心，山东 莱阳 265200）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis, HPS）是严重威胁生猪养殖业的重大细菌性病原体之一，是猪呼吸道病综合征的一种重要病原[1-2]。近些年来，随着世界养猪业的快速发展，副猪嗜血杆菌病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病之一，一些免疫抑制性呼吸道病原，如繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、圆环病毒2型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）等感染，使得该菌常作为继发感染病原而加剧病情，给养猪业造成了严重的损失，引起了国内外养猪业者的高度重视[3-4]。

HPS是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性、短小或呈细丝状的多形态小杆菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，无鞭毛、无芽孢、有荚膜，但体外培养时易丢失[5]。HPS体外培养时生长缓慢，初次分离培养需要供给5%的CO2；对营养物质的需求苛刻，须在含血清及辅酶等生长因子的巧克力培养基或胰蛋白大豆琼脂上才能生长；若在培养基上划线方式接种金黄色葡萄球菌，HPS可在划线两旁形成直径约1～2 mm的“卫星菌落”。根据表型特征和致病性，传统的血清学方法可将HPS分为15个标准血清型（1～15），但存在一部分临床分离株无法分型[6]，其中1、5、10型为强毒力菌株，8和15型为中等毒力菌株[7-8]。流行病学调查表明，我国HPS流行血清型呈不断变化的趋势，2014年以前我国主要以血清4型和5型最为流行，其次为13、14和12型[9]；2014—2021年，我国HPS主要优势血清型为1、2、4、5、7、12和13型，无法分型菌株比例呈升高趋势[10-11]。

HPS可单独感染哺乳和保育仔猪，常常引起病毒性呼吸道疾病（如繁殖与呼吸综合征、圆环病毒病等）的继发感染。临床上患病猪多表现为厌食、精神萎靡、采食量逐渐减少、关节肿大，部分猪出现食欲不振以及呼吸困难、咳嗽等呼吸道症状；慢性病例可见被毛粗乱、生长发育不良，甚至成为僵猪[12-14]。本试验对山东省莱阳市某规模猪场疑似HPS感染的发病猪进行了病原菌分离培养、鉴定及药敏试验，对发病猪群进行了诊治，试验结果将为HPS的诊断和防控提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 病料采自山东省莱阳市某规模猪场发病的保育仔猪肺脏、关节液、心包积液等。

1.1.2 试验试剂 胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar, TSA）购自Dfico TM公司，新生小牛血清购于杭州四季青有限公司，辅酶（NAD）、琼脂糖购于上海生工生物工程有限公司，微量生化发酵管购自杭州天和微生物有限公司，Trans Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2 000-DNA ladder Marker购自北京全式金生物有限公司，16S rRNA PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；MgCl2（氯化镁）购自宝生物（大连）有限公司。

1.1.3 培养基的配置 胰蛋白大豆琼脂（Tryptic Soy Agar, TSA）：称取TSA粉末40 g，溶于1 000 mL蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，待冷却至40～45 ℃时加入30 mL新生小牛血清和0.05% 辅酶（NAD）10 mL，混匀后立即倾倒平板。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯化 对发生纤维素性心包炎的病料采集心包积液，关节肿大者抽取关节积液涂布于TSA平板上；纤维素性胸膜炎者可采集肺脏，无菌操作取深层组织涂布TSA平板；有神经症状者，开颅后无菌钩取脑组织划线接种TSA平板进行细菌分离。首次培养应将平板置于5% CO2（二氧化碳）的培养箱中或烛缸中，置于37 ℃恒温培养箱中培养12 h后观察细菌的生长。挑取大小约为0.51 mm左右的灰白色或半透明的疑似菌落进行革兰氏染色并镜检。

1.2.2 生化鉴定 在无菌操作台上，用接种环分别挑取经纯化的待鉴定单菌落，水平划线于新的TSA培养基上37 ℃培养12 h。挑取菌落接种于尿酶、氧化酶、接触酶、硝酸盐还原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖等微量生化鉴定管中，同时加入2 µL 0.05% NAD及5 µL新生小牛血清。置于37 ℃培养箱中，24 h及48 h各观察1次，按厂家说明书判定结果。

1.2.3 PCR鉴定 用接种环刮取2个菌落洗脱于含100 µL灭菌双蒸水的1.5 mL EP管中。沸水浴10 min后迅速放入-20 ℃冰箱中，放置30 min取出室温融化。10 000 r/min离心5 min，取上清液即为PCR检测时的DNA模板。根据Oliveira等的方法进行PCR反应，引物序列为Forward：5'-G T G A T G A G G A A G G G T G G T G T-3，Reverse：5'-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3[15]。反应完后取5 µL PCR产物与1 µL 6×loating buffer 混匀后加到浓度为1.2%的琼脂糖制备的凝胶点样孔中，电泳30 min后置于凝胶成像系统下观察条带。

1.2.4 药敏试验 取复壮后的菌落3～5个接种于3 mL TSB培养基中，每株菌接种2～3管，37 ℃180 r/min振荡培养16 h。将菌液调至与麦氏比浊管第3管（大约3×108CFU/mL）一致，备用。吸取100 µL制备好的菌液于TSA培养基上，涂开，烘干后贴上药敏试纸片。37 ℃培养24 h 后用游标卡尺测量抑菌圈直径，重复1次，取其平均值为最终抑菌圈直径。依据CLSI/NCCLS标准[16]，抑菌圈直径大于30 mm判定为高度敏感，30 mm＜抑菌圈直径≤20 mm判定为敏感，抑菌圈直径小于20 mm判定为不敏感。

2 结果

2.1 发病症状及剖检病变

该场为自繁自养“一点式”饲养猪场，能繁母猪约为200头。自2021年10月底，30～45日龄保育仔猪开始出现被毛粗乱、精神萎靡、食欲不振、呼吸困难、逐渐消瘦等症状（图1A），发病比例约为15%，死亡率约为3%。2021年11月中旬，选择3头典型发病仔猪进行临床剖检，可见腹腔粘连（图1B），心包积液（图1C），心脏表面纤维素性渗出（图1D），胸腔壁纤维性黏连（图1E）以及关节腔积液（图1F）。

2.2 副猪嗜血杆菌分离纯化与鉴定

将样品接种在TSA培养基上，37 ℃培养36 h后，菌落呈灰白色半透明，表面光滑、湿润，直径约为11.5 mm，与对照HPS菌落形态类似（图2A）。镜检可见该菌为革兰氏阴性、多形态的杆菌（图2B）。将分离的两株HPS接种于微量生化发酵管中，37 ℃培养24～48 h后，结果为尿酶、吲哚试验、氧化酶试验阴性，过氧化氢（接触酶）、硝酸盐还原试验阳性，该菌可以发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、核糖、麦芽糖和半乳糖，符合副猪嗜血杆菌的特征（表1）。根据HPS 16S rRNA序列设计引物经PCR扩增的产物为822 bp大小的片段，与预期条带大小一致（图3）。

图2 副猪嗜血杆菌分离形态、革兰氏染色结果

图3 副猪嗜血杆菌PCR检测琼脂糖凝胶电泳结果

表1 HPS临床分离株的生化鉴定结果

2.3 药敏试验结果

通过对抑菌圈的观察和直径测量分析，分离菌对头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星、泰妙菌素高度敏感，对氨苄西林、青霉素G、头孢唑啉、环丙沙星、氧氟沙星、红霉素、磺胺嘧啶敏感，对庆大霉素、四环素、林可霉素不敏感（表2）。

表2 分离菌药敏试验结果 mm

3 讨论与分析

根据患病猪群的临床症状、病理解剖，结合分离培养的菌落和菌体形态观察，初步鉴定为HPS。进一步采用生化鉴定和PCR扩增结果确定所分离的病原菌为HPS。经过上述检查，确诊本次疫情为副猪嗜血杆菌病。HPS的分离培养常常受到病料采集之前使用抗生素治疗以及病料转运时间等因素的影响，加之对营养要求苛刻，使得即使是从临诊确定为副猪嗜血杆菌病的病料分离HPS也很困难[17]。因此，采用适合该菌生长需要的培养基能够增加分离率。最好选择处于疾病急性期且没有应用抗生素的典型病料，发生过副猪嗜血杆菌感染已好转但仍然有纤维素性浆膜炎症状的样品通常不能分离到该菌[18]。本试验发现HPS临床分离株对大多数头孢类、喹诺酮类药物高度敏感，对氨基糖苷类药物耐药，其耐药情况与其他地区分离菌类似[17，19]。针对发病猪只用头孢噻呋钠注射液进行治疗，对全群仔猪用恩诺沙星保健7 d，2周后疫情得到了控制。

HPS是猪上呼吸道的常在寄居菌，与机体的抵抗力之间存在一种动态平衡关系，当机体抵抗力下降时该菌可侵入机体而引起发病[20]。分离病料同时做了PRRSV和PCV2检测，结果表明3份样品PRRSV和PCV2均为阴性，说明本次感染主要由HPS引起。但临床上常常会出现HPS与其他病原混合感染的现象，常作为猪繁殖与呼吸综合征的继发感染而加重临床症状，造成更高的死亡率[21-22]。PRRSV、PCV2等呼吸道原发病原的感染均可以造成机体的免疫抑制，使得免疫力下降，为HPS的入侵创造了条件[23-24]。因此做好其他呼吸道疾病的免疫，制定科学免疫程序，定期开展疫苗免疫后抗体监测，并注重饲料营养、环境卫生，将有助于预防副猪嗜血杆菌病的发生。