陆地棉GhUGT76C1基因克隆、生物信息学分析及功能初探

唐成芬，林文妮，Josee ornella musaniwabo，刘爱玉，屠小菊

(1.湖南农业大学农学院，长沙 410128；2. 湖南农业大学生物科学技术学院， 长沙 410128)

【研究意义】棉花为世界上最重要的经济作物之一，是纺织工业中最重要的可再生纤维[1]。矮化棉花品种能够有效提高光能利用率和收获指数，解决不耐肥的问题，并具有适宜密植及机械化管理、无公害、提高产量、降低劳动强度和节约成本等特点[2]。【前人研究进展】细胞分裂素在拟南芥、水稻等植物中具有调控植物矮化的功能，但是未见与棉花矮化相关的报道。水稻OsAHP1基因和OsAHP2基因RNAi突变体表现出CK信号途径缺陷和节间长度变小导致矮化的表型[3]。OsCKX4/RootEnhancer1(ren1-D)是CKX同源基因，其显性突变的植物表现出细胞分裂素水平降低及半矮化表型[4]。OsCKX9介导细胞分裂素降解，其突变体株高降低[5]。OryzasativaVIN3-LIKE2(OsVIL2) 通过与细胞分裂素降解基因OsCKX2的启动子结合来影响株高和生物量[6]。在拟南芥中，过量表达陆地棉GhDREB1基因会导致拟南芥矮化、晚开花及对细胞分裂素的敏感性降低的表型，这与2个CK信号途径中的2个关键组分type-B和type-A的ARRs抑制表达相关[7]。在植物体内细胞分裂素稳态的复杂过程中，N-葡萄糖基化是调控植物体内细胞分裂素代谢平衡的重要机制之一[8]。UGT76C1基因是细胞分裂素N-糖基转移酶基因，糖基转移酶UGT76C1在植物体内可使细胞分裂素发生糖基化修饰并使细胞分裂素失活和参与调控植物对细胞分裂素的响应[6，9]。UGT76C1和UGT76C2能够催化细胞分裂素形成细胞分裂素 N(7)-葡萄糖苷和N(9)-葡萄糖苷，UGT76C1缺失突变体ugt76C1细胞分裂素N-糖苷的积累显著降低，而UGT76C1过表达株增加了细胞分裂素N-糖苷的积累，葡萄糖基转移酶UGT76C1可以通过细胞分裂素的N-葡萄糖基化精细调节植物中的细胞分裂素反应[10]。拟南芥中UGT76C1基因与细胞分裂素的含量有重要关系，在拟南芥UGT家族中，只有UGT76C1、UGT76C2和UGT85A13个基因可使细胞分裂素失活[11]。但是目前未见UGT76C1基因调控植物矮化的报道。【本研究切入点】湖南农业大学棉花研究所前期通过蛋白质组学研究发现，GhUGT76C1基因与陆地棉矮化突变体LA-1的矮化密切相关。本实验通过克隆陆地棉GhUGT76C1基因并进行生物信息学分析，转化拟南芥获得过量表达转基因株系，并观察不同光质光强条件下的表型性状。【拟解决的关键问题】为进一步研究GhUGT76C1基因的功能及其与LA-1矮化的相关性奠定基础，为筛选陆地棉矮化基因及解析陆地棉矮化突变体LA-1矮化的分子机理提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

陆地棉矮化突变体LA-1材料由湖南农业大学棉花研究所提供。本文用于保存质粒与扩繁的菌种为大肠杆菌DH5α，所用质粒型号为pCUbi1390，用于转染拟南芥所用菌种为农杆菌GV3101，均为湖南农业大学棉花研究所实验室保存菌种。RNA提取及逆转录试剂盒由SIGMA公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1GhUGT76C1基因克隆 以陆地棉矮化突变体LA-1叶片为材料，采用SIGMA公司RNA提取试剂盒提取总 RNA。将RNA反转录成 cDNA，设计引物序列(UGT76C1-F：5′-TGCACTAGGTACCTGCAGATGAAACTGAAGGGTCGTGGATC-3′；UGT76C 1-R：5′-GGATCCGTCGACCTGCAGCATAGAAAGTAT GTAACTAACCAAATTGTC-3′)，进行 PCR 扩增，将PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.2GhUGT76C1基因生物信息学分析 将克隆得到的GhUGT76C1基因的cDNA序列用NCBI(http://ncbi.nlm.ncih.gov/)中的Blastn和Blastp进行生物信息学分析，使用proparam (https://web.expasy.org/protparam/)在线工具和DNAStar软件对编码蛋白的理化性质进行分析，利用SOPMA对陆地棉GhUGT76C1蛋白的二级结构进行预测。在NCBI基因库中选取不同物种的UGT76C1基因进行序列比对，并选取其cds序列，用MEGAX构建系统发育树。

1.2.3GhUGT76C1基因过量表达载体构建及转化农杆菌 将pCUbi1390载体进行Pst1单酶切，使用PCR产物纯化试剂盒将酶切产物及克隆得到的PCR产物进行纯化，通过连接酶连接并转化大肠杆菌EscherichiacoliDH5α，筛选获得阳性克隆，得到的重组质粒采用液氮冻融法导入农杆菌GV3101感受态中，筛选阳性菌落，并通过菌落PCR验证，将检测成功的阳性菌液送北京擎科生物科技有限公司进行测序验证。

1.2.4GhUGT76C1基因过量表达转基因株系的筛选及表型分析 利用浸花法将测序成功的农杆菌转化野生型拟南芥Col-0，并筛选阳性苗，获得GhUGT76C1过表达转基因株系。为了研究GhUGT76C1基因在植物生长过程中发挥的作用，将Col-0和GhUGT76C1过表达转基因株系材料分别放置在黑暗、白光、蓝光、红光及远红光下进行培养，光强设置为 0.1、1.0、10.0、30.0 μmol/(m2·s)，6 d后，每个处理取10株拟南芥测量下胚轴长度。

2 结果与分析

2.1 GhUGT76C1基因克隆

以陆地棉矮化突变体LA-1叶片为材料，提取总 RNA，电泳检测显示RNA条带清晰，能够进行下一步实验。将RNA反转录成 cDNA，用UGT76C1-F和UGT76C1-R引物进行 PCR 扩增，获得约1400 bp PCR产物(图1)，测序结果表明，得到1447 bp的片段，在NCBI的BLAST比对中发现，克隆得到的序列与GossypiumhirsutumUDP-glycosyltransferase76C2-like基因(GenBank:XM_016830413.1)序列同源性高达99.77%，表明成功克隆了GhUGT76C1基因。

A: 陆地棉RNA检测; 1, 2, 3: RNA条带; B: GhUGT76C1基因克隆; M: DL2000 DNA marker; 1, 2: GhUGT76C1基因扩增产物A: RNA detection of upland cotton; 1, 2, 3: RNA stripe; B: Cloning of GhUGT76C1; M: DL2000 DNA marker; 1, 2: Amplification product of GhUGT76C1 gene图1 陆地棉RNA提取及GhUGT76C1基因克隆Fig.1 RNA extract from Gossypium hirsutum and cloning of GhUGT76C1

2.2 GhUGT76C1基因的开放阅读框及理化性质分析

根据陆地棉GhUGT76C1基因cds序列进行开放阅读框(图2)分析，序列中有1个最长为1365 bp的开放阅读框，其中起始密码子位于1 bp处，终止密码子位于1365 bp处。使用BLAST和DNAstar等软件得出的结果一致，推测此开放阅读框可编码455个氨基酸。使用proparam在线工具和DNAStar软件对编码蛋白的理化性质进行预测，该序列编码产物的分子式为C4190H7017N1365O1770S286，原子总数为14 628。理论分子量约为 51.31 kD，不存在二硫键。理论等电点为5.40，编码的 454个氨基酸中，组成最多的是Ala，所占比例为5.1%。带负电荷的残基总数为52，带正电荷的残基总数为40，不稳定系数为44.94，GhUGT76C1基因编码不稳定蛋白。亲水性的平均值(GRAVY)为0.065，为疏水性蛋白。

图2 陆地棉GhUGT76C1基因序列的ORF分析Fig.2 ORF analysis of GhUGT76C1 gene sequence in Gossypium hirsutum

2.3 陆地棉GhUGT76C1蛋白结构及氨基酸序列同源性比对分析

利用SOPMA对陆地棉GhUGT76C1蛋白的二级结构(图3)预测，GhUGT76C1蛋白由ɑ-螺旋、无规卷曲、延伸链以及β-转角组成，分别占43.39%，35.68%，13.66%和 7.27%。利用NCBI上的blastp程序检索同源蛋白，获取多个物种的UGT76C1 同源蛋白序列(图4), 物种包括水蜜桃(Prunuspersica,ID: 18786137)、葡萄(Vitisvinifera,ID: 100244489)、小麦(Triticumaestivum,ID: 1004 15862)、花生(Arachishypogaea,ID: 112736258、拟南芥(Arabidopsisthaliana,ID: 821732)、陆地棉(Gossypiumhirsutum,ID:107931078)、黄连苔草(CoptischinensisFranch,ID: 1000500)。利用MEGA构建系统进化树可以看出陆地棉与拟南芥同源蛋白在进化过程中属于同一分支，亲缘关系最近。

蓝色: ɑ-螺旋; 橙色: 无规卷曲; 红色: 延伸链; 绿色: β-转角Blue: Alpha helix; Orange: Random coil; Red: Extended strand; Green: Beta turn图3 GhUGT76C1蛋白二级结构Fig.3 Secondary structure of GhUGT76C1 protein

图4 陆地棉GhUGT76C1蛋白系统发育树分析Fig.4 Analysis of development tree of Gossypium hirsutum GhUGT76C1 protein system

2.4 陆地棉GhUGT76C1基因过表达载体构建

将GhUGT76C1基因及pCUbi1390载体进行酶切连接，并转化大肠杆菌E.coliDH5α，挑选阳性克隆进行PCR检测，结果表明，克隆的基因序列与NCBI基因序列完全一致，说明成功构建了pCUbi1390-GhUGT76C1重组质粒。将得到的重组质粒采用液氮冻融法导入农杆菌GV3101感受态中，菌液PCR鉴定阳性转化子 (图5)。其中1、2、3号样本都成功导入了重组质粒，含有目的基因, 可以直接应用于植物的遗传转化。

M: Trans 5K marker;1, 2, 3号为PCR产物M: Trans 5K marker;No.1, 2, 3 is the PCR product图5 重组质粒菌液PCR检测Fig.5 Detection of recombinant plasmids by Escherichia coli gel electrophoresis

2.5 不同光质光强处理下GhUGT76C1基因过表达转基因株系表型分析

黑暗条件下，GhUGT76C1过表达转基因株系下胚轴长度显著大于Col-0(图6)，白光处理条件下，2种材料的下胚轴长度无显著差异。不同光强度的蓝光、红光、远红光处理条件下，GhUGT76C1过表达转基因株系与Col-0的下胚轴长度存在差异，尤其是在蓝光及远红光处理条件下，差异较明显。其中在光强为0.1和1.0 μmol/(m2·s)蓝光处理条件下，两种材料的差异达到显著水平；0.1 μmol/(m2·s)远红光光强处理条件下，过表达转基因株系下胚轴长度明显大于Col-0；在不同光照强度红光处理条件下，过表达转基因株系的下胚轴长度均大于Col-0，但是差异不显著。说明GhUGT76C1基因在黑暗及低光强蓝光及远红光条件下对植株下胚轴生长发挥正调控作用。

A, B, C, D, E分别表示黑暗, 白光, 蓝光, 红光, 远红光处理A, B, C, D and E represent dark, white, blue, red, and far-red processing，respectively图6 黑暗、白光及不同光质处理下突变体下胚轴长度Fig.6 Hypocotyl length of mutants treated with dark, white and different light quality

3 讨 论

自1922年Parnell发现矮化水稻后，60多种矮化的水稻被检测出来[12]。另外，在小麦、玉米、大豆及甘蓝型油菜等多种作物上均发现了不同种类的矮化突变体[13-16]。目前，关于矮化突变体的研究主要集中在植物激素调控矮化方面，包括植物形态、细胞学和激素调控矮化的机理研究等[17]。研究表明，多数植物矮化突变体都是激素合成途径或者应答调节发生突变使植物茎的生长发育发生改变造成的[18]，主要与植物赤霉素(GA)和油菜素类固醇(BR)有关，少数与其他激素相关[19]。细胞分裂素能够调控植物生长和发育的各个方面，包括细胞分裂、芽的萌发和分化、种子发育等，在植物生长中发挥极其重要的作用[20]。

目前，关于细胞分裂素N-糖基转移酶基因研究的报道较少，更未见该基因调控陆地棉株高的研究。本研究在前期蛋白质组学研究的基础[21]上，筛选得到的GhUGT76C1基因可能与陆地棉矮化突变体LA-1的矮化相关。并克隆获得约1400 bp PCR产物，在NCBI的BLAST比对中发现，克隆得到的序列与GossypiumhirsutumUDP-glycosyltransferase76C2-like基因(GenBank:XM_016830413.1)序列同源性达99.77%。生物信息学分析发现其序列中有一个最长为1365 bp的开放阅读框，编码455个氨基酸。并对GhUGT76C1基因的理化性质、二级结构等进行了深入的分析，本研究首次成功克隆了陆地棉GhUGT76C1基因。

葡萄糖基转移酶 UGT76C1 能够对 N(7)-和 N(9)-位置的不同细胞分裂素进行 N-葡萄糖基化，最早在拟南芥中被发现，拟南芥中UGT76C1基因调控细胞分裂素在植物体内的含量，在细胞分裂素代谢途径中，udp-糖基转移酶通过细胞分裂素的糖基化，对细胞分裂素进行修饰，对维持细胞正常的生理活动有极其重要的作用[6]。但是还未见关于UGT76C1基因调控植物株高的研究。本研究通过构建GhUGT76C1基因的过量表达载体，并转化拟南芥获得了转基因株系。通过对转基因株系的表型分析发现，黑暗及较低强度的蓝光和远红光处理条件下，UGT76C1基因过表达突变体下胚轴长度均大于Col-0。研究表明，不同激素之间可以通过相互作用调节植物生长。MsGH3.5的过表达可以显著增加植物体内CK含量，降低游离IAA含量，导致突变体表现出明显的矮化表型[22]。黑暗诱导的生长的主要特征是下胚轴的快速伸长，植物中ABA 缺乏导致下胚轴生长减少，外源ABA可恢复生长，ABA通过增强编码细胞周期蛋白依赖性激酶 SlKRP1 和 SlKRP3 抑制剂的基因的表达以及降低细胞分裂素水平来促进 DNA 核内复制从而导致下胚轴的增长[23]，在黑暗及不同的弱光照处理条件下，GhUGT76C1基因过量表达是否通过使CK失活，导致GhUGT76C1过量表达转基因株系ABA含量增加，从而使其下胚轴较长，GhUGT76C1是否通过调控不同激素之间的含量变化，从而引起株高表型差异，还有待进一步的研究。

4 结 论

本研究成功克隆了陆地棉GhUGT76C1基因，基因全长1447 bp，cds序列1365 bp，编码454个氨基酸，成功构建了陆地棉GhUGT76C1基因过量表达载体，并转化拟南芥获得过量表达转基因株系，过量表达转基因株系在黑暗、低光强蓝光及远红光条件下均出现显著的下胚轴增长的表型。