甜瓜抗白粉病的苗期鉴定

2022-12-05康保珊郝小苑吴会杰刘莉铭古勤生

中国瓜菜 2022年11期

康保珊，郝小苑，吴会杰，彭斌，刘莉铭，古勤生

（中国农业科学院郑州果树研究所郑州 450009）

白粉病是甜瓜生产中一种重要的真菌性病害，从植株苗期到成熟期均可发生，但在中、后期危害严重，主要危害叶片，严重时亦可危害叶柄、茎蔓和果实。白粉病发生初期在叶面产生白色粉斑，随后病斑迅速扩大连片，白粉层加厚，叶片逐渐萎黄干枯，植株光合效能减弱，严重影响果实产量和品质。近年来，随着我国现代农业发展和产业结构转型升级，设施甜瓜种植面积不断扩大，其特有的高温、高湿环境条件，加剧白粉病的发生和危害。目前生产中防治该病害仍然过度依赖化学农药，而过量使用农药带来的药害、环境污染和抗药性等问题日益突出。因此，选育推广抗白粉病甜瓜品种显得尤为迫切。

抗病性鉴定是选育和推广抗病品种的关键步骤，鉴定结果受多种因素的影响，包括孢子悬浮液浓度、苗龄和调查时间等。田间接种鉴定不仅耗时长，而且环境条件变化大易导致重复性差、鉴定不准确等问题。目前大多数研究采用室内苗期喷雾法接种鉴定[1-4]，但接种的具体参数和细节不尽相同。首先接种苗龄不同，有文献报道甜瓜白粉病接种宜在子叶展开时进行[5-6]，但也有报道显示最佳接种时期为2 叶1 心期或4 叶1 心期[7-9]；其次，接种采用的孢子浓度不同，从103～106个·mL-1均有报道[1，6，9-10]；鉴定方法的差异可能导致不同的鉴定结果。为此，笔者通过设置不同接种参数分析接种白粉病后甜瓜的病情指数，确定耗时短且结果稳定的鉴定方法，以期为培育抗白粉病的甜瓜新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2021 年9 月至2022 年5 月在中国农业科学院郑州果树研究所进行。为筛选高效的接种方法，供试材料选用经前期试验确定具有抗性差异的6 个甜瓜品种，其中白玫由新疆农业科学院哈密瓜研究中心惠赠；MJ21、SD4、SD6 为F1 代杂交种，MX-20、VP-20 为自交种，均来自中国农业科学院郑州果树研究所。MX-20 和VP-20 分别为高感和高抗品种，其他4 个品种抗性依次为SD4>SD6>白玫≈MJ21。

供试白粉病病原菌：采集于中国农业科学院郑州果树研究所试验基地大棚内具有典型白粉病病斑的甜瓜病叶，分离物经形态学鉴定确认为单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）后，接种于健康的甜瓜品种MX-20 上进行繁殖，新长出的孢子作为接种用病原体；病原菌采用活体保存，病株置于光照培养箱中生长。

1.2 处理方法

供试甜瓜品种催芽后，播种于装有灭菌土的营养钵中，于23～27 ℃培养室条件下生长，常规管理，待幼苗生长到接种所需时期后转移到培养箱中待用。

将白粉病病菌孢子收集到含0.05%（φ）吐温20的无菌水中，充分震荡，取少量稀释一定倍数后用血球计数板镜检计数，确定原始孢子悬浮液浓度，在此基础上进行10 倍梯度稀释，分别制成不同浓度梯度的孢子悬浮液，采用喷雾接种法均匀喷洒到幼苗叶片上，放置于人工气候箱中黑暗培养24 h，培养条件：25 ℃，湿度75%；之后置于培养箱中，培养条件：23 ℃黑暗10 h，26 ℃光照14 h，湿度65%；待植株发病后统计病情指数。

不同接菌时期试验于2021 年进行，供试品种为SD4、SD6、白玫和MX-20；设3 个接种时期：子叶期、2 叶1 心期、4 叶1 心期。确定最佳接种时期后于2022 年进行不同接种浓度试验，供试品种为VP-20、SD4、MJ21 和MX-20，设置4 个孢子悬浮液浓度，分别为107、106、105、104个·mL-1。采用单因素分析方法，即分析接种时期时采用105个·mL-1喷施，于接种后12 d 调查病情指数；分析孢子悬浮液浓度时在2 叶1 心期喷施，分别于接种后8 d 和12 d 调查病情指数。每个处理12 株，3 次重复。

1.3 病情分级及抗性评价

病情分级及抗性评价标准参考文献[11]及国家行业标准《黄瓜主要病害抗病性鉴定技术规程第2 部分：黄瓜抗白粉病鉴定技术规程》（NY/T 1857.2－2010）[12]中的方法进行。具体如下：以幼苗叶片出现病斑为感病指标，从叶片出现症状时开始统计。调查每个单株叶片病情级别，按照以下标准进行分级：0 级，叶片无病症；1 级，叶片病斑小且少，占叶片总面积的1/3 以下；2 级，白粉病斑较明显，发病叶病斑面积占叶片总面积的1/3～2/3；3 级，白粉状病斑连片为较大的病斑，发病叶病斑面积占叶片总面积的2/3 以上；4 级，白粉层浓厚，叶片病斑开始黄化；5 级，叶片病斑变褐干枯，或病叶枯死。病情指数按照下面公式计算：

病情指数（DI）=Σ（各级病叶数×该级代表值）/调查总叶数×最高级数×100。

抗性评价标准如下：免疫（I）DI=0；高抗（HR）0＜DI≤15；抗病（R）15＜DI≤35；中抗（MR）35＜DI≤55；感病（S）55＜DI≤75；高感（HS）DI＞75。

1.4 数据分析

利用SPSS 16.0 软件对试验数据进行单因素方差分析，采用Duncan’s 新复极差法检验差异显著性。

2 结果与分析

2.1 白粉病病原菌镜检观察

收集白粉病孢子后取少量在显微镜下观察，镜检结果显示分生孢子均为椭圆形、单胞，串生呈念珠状，且具有纤维状体（图1-A，B），根据其分生孢子形态及内部含有发达的纤维状体等特征初步确定笔者采集的白粉病菌为单囊壳属单囊壳白粉菌（P.xanthii）。

图1 白粉病病菌孢子

2.2 接种时期对甜瓜品种病情指数的影响

调查结果显示，叶片最早开始出现白粉状病斑的时间是接种后7～8 d，3 个接种时期无明显差异。由表1 可知，4 个品种在2 叶1 心期接种的病情指数与4 叶1 心期相比较，病情指数差异均不显著；除SD4 外，其他3 个品种在子叶期接种的病情指数与真叶期呈显著差异。说明子叶期接种鉴定容易产生较大误差，造成抗性评价不准确，而相比2 叶1心期，植株生长到4 叶期需要更长的时间和更大的空间，因此，确定2 叶1 心期为甜瓜幼苗接种鉴定的最佳时期。

表1 甜瓜接种白粉病12 d 后的病情指数

2.3 孢子浓度对甜瓜品种病情指数的影响

由表2 和图2 可以看出，孢子浓度为104个·mL-1时，4 个品种只有MX-20 和MJ21 在接种后12 d 出现白粉状病斑，且病情指数均小于35，未达到感病级别；孢子浓度为105个·mL-1时，4 个品种中MX-20 和MJ21 在接种后8 d 的病情指数分别为38.20 和23.93，到接种12 d 时病情发展变缓，病情指数分别为75.15 和67.76，VP-20 和SD4 在接种后8 d 时均无明显的发病症状，到接种后12 d 时的病情指数分别为4.63 和30.25，此时4 个品种表现出不同的抗性差异；孢子浓度为106个·mL-1时，4 个品种在接种后8 d 和12 d 的抗性等级均在同一等级，但品种间抗性存在差异；孢子浓度为107个·mL-1时，除MJ21 外，其他3 个品种在接种后8 d 和12 d的病情指数也显示为同一抗性等级。另外，除SD4外，同一个品种接种浓度为105个·mL-1、接种后12 d的病情指数与浓度为106个·mL-1、接种后8 d 的病情指数差异不显著，抗性等级相同。上述结果表明，有效接种的孢子浓度须高于104个·mL-1；随着孢子浓度增大，病情发展速度加快，鉴定周期缩短；试验结果显示，孢子浓度为107个·mL-1时，病情发展迅速，接种8 d 时感病品种MX-20 病情指数已达到82.50，对于抗病（R）或中抗（MR）品种（如SD4）容易出现病情指数偏高、抗病性偏差的结果；孢子浓度为105～106个·mL-1时，病情发展速度适中，品种间抗性存在差异，因此确定孢子浓度为105个·mL-1、接种后12 d 调查或孢子浓度为106个·mL-1、接种后8～12 d 调查为合适的接种鉴定条件。

表2 不同孢子浓度接种甜瓜后的病情指数

图2 甜瓜品种接种白粉病菌P.xanthii（孢子浓度为105 个·mL-1，8 d）发病情况

3 讨论

白粉菌是一种专性寄生菌，只能在活体寄主上存活，目前的研究表明子囊菌亚门下有3 个属6 个种的真菌均可引起葫芦科植物白粉病，在我国致使葫芦科作物发病的主要是单囊壳属单囊壳白粉菌（P. xanthii）和白粉菌属二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）[13-16]。这两种白粉病菌产生所需要的环境条件不同，相对高温高湿的条件下白粉病的发生主要由单囊壳白粉菌引起，在相对干燥的条件下白粉病多由二孢白粉菌引起，目前大多数研究鉴定的白粉病菌均属于单囊壳白粉菌，笔者采集的白粉病菌经鉴定也属于单囊壳白粉菌，与赵光伟等[17]的鉴定结果一致。报道显示其分生孢子萌发的最适条件为温度25 ℃，相对湿度100%[18]。然而笔者在繁殖白粉病菌时观察到当相对湿度达到100%时，叶片产生露水，此时叶片上白粉状病斑扩展缓慢，白粉病菌产孢减少。于静等[19]在研究茄白粉菌的生物学特性时也发现分生孢子一旦浸在水滴中就不再萌发。前人研究表明充足的氧气对于孢子的萌发至关重要，当环境湿度过大导致叶片表面有凝结水时，孢子周围氧气减少即可能导致孢子不萌发，影响最终鉴定结果[18-19]。

白粉病抗性鉴定的相关文献中有选择在子叶期进行接种鉴定的[2，5，20]，主要是因为子叶期接种耗时短，占用空间小，操作方便。但在笔者的研究中发现子叶期接种鉴定结果相比真叶期有显著差异，如甜瓜品种白玫子叶期接种病情指数是33.81，表现为抗病，但真叶期接种病情指数可达到58.83～60.39，表现为感病，说明子叶和真叶的抗性存在差异。臧全宇等[7]研究指出某些甜瓜材料在子叶期抗性会增强；Ben-Naim 等[21]研究西瓜白粉病抗性时发现子叶期与真叶期抗性的差异是由于抗性基因的不同，子叶期抗性受1 对不完全显性基因控制，而真叶期抗性是由3 对互补的不完全显性基因控制。另外，光合效率也是影响植株抗性的一个重要因素，甜瓜子叶的光合效率显著低于真叶，产生抗性物质的速率和含量与真叶差异较大，这可能也是造成子叶与真叶抗性鉴定结果差异的一个重要原因[22-24]。王禄星等[9]认为苗龄为4 叶1 心期是接种的最佳时期，笔者的研究结果表明，4 叶1 心期和2叶1 心期接种结果差异不显著，而且相比4 叶1 心期，在2 叶1 心期接种鉴定周期缩短，效率提高，是最佳接种时期，这与张若纬等[8]的研究结果一致。

孢子浓度是影响病情指数的一个重要因素。笔者的研究结果表明，当孢子悬浮液浓度低于105个·mL-1时，植株不发病或病情发展缓慢，病情指数偏低。王迪等[25]报道，当接种孢子浓度为104个·mL-1时，甜瓜发病率仅为48%，表明甜瓜白粉病的有效接种浓度须高于104个·mL-1。另外，笔者的研究结果表明，当孢子浓度达到107个·mL-1时，植株发病迅速，病情指数偏高，抗病品种表现为中抗，因此孢子浓度过低或过高都可能对品种真实抗性水平的影响产生较大差异。目前多数文献报道采用的孢子浓度为105个·mL-1，笔者研究发现，当孢子浓度为106个·mL-1时，植株发病相对较快，接种后8 d 即可进行统计调查，但需菌量相对105个·mL-1较大。因此，在鉴定时可根据实际情况选择孢子浓度及相应的调查时间。

总之，快速高效的接种鉴定方法可提高抗性种质筛选、抗性品种选育的效率，笔者筛选出的接种条件对于其他葫芦科作物的抗性鉴定具有一定的参考价值。