基于网络药理与分子对接研究4味药食两用中药治疗2型糖尿病的机制

褚 煜， 陈 海， 吕宏阳， 陈 艳， 王 建*

(1.成都中医药大学公共卫生学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学西南特色中药资源重点实验室，四川 成都 611137；3.西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137；4.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137)

糖尿病是以胰岛β细胞受损以及胰岛素抵抗为主要病理特征的慢性代谢性疾病，主要分为1型糖尿病、2型糖尿病以及特殊类型糖尿病，临床上以2型糖尿病患者居多[1]。2型糖尿病患者需要长期甚至终身用药治疗，但长期口服降糖药物对肝肾损害较大，且随着用药时间的延长会出现药物继发性失效等问题[2]。

药食两用中药具有“多成分”“多靶点”“多通路”等特点与优势，且毒副作用小、不良反应少，适合预防与治疗2型糖尿病[3]。课题组前期基于辅助降血糖保健产品药食两用中药原料统计[4]以及2020年版《中国药典》中降糖处方的数据挖掘结果，优选出4味防治2型糖尿病的药食两用中药，分别为黄芪、山药、葛根、人参，但其防治2型糖尿病的机制不明，故本文结合网络药理学“多成分-多靶点-多通路”的分析优势联合分子对接结果，对其治疗2型糖尿病的可能机制进行了探讨。

1 材料

药品标准查询数据库(https://www.drugfuture.com/standard/)；药理学数据库和分析平台(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；人类基因数据库(https://www.genecards.org/)；比较毒物基因数据库(http://ctdbase.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step)；化学数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；蛋白质数据库(http://www1.rcsb.org/)。Spass Modeler、Cytoscape3.6.1、Autodock Vina、Pymol等软件。

2 方法

2.1 数据挖掘 以“消渴”“消渴病”“降糖”“糖尿病”“2型糖尿病”为检索词，检索2020年版《中国药典》和药品标准查询数据库，获取降糖处方数据。Spass Modeler进行频次、链接强度统计分析，导入Cytoscape绘制网络图，再结合糖尿病保健食品中排序前10的药食两用中药[4]，取交集后优选出4味。

2.2 药物及疾病靶点筛选 从药理学数据库和分析平台(TCMSP)中检索获取黄芪、山药、葛根、人参主要成分及作用靶点，检索条件为生物利用度(OB)>30%，类药性(DL)>0.18，并在蛋白质数据库(Uniprot)中对成分作用靶点进行基因ID转换。人类基因数据库(GeneCards)与比较毒物基因数据库(CTD)中检索与2型糖尿病相关的所有疾病靶点，中位数筛选保留相关性较强的疾病靶点后合并去重，将药物成分作用靶点与2型糖尿病相关疾病靶点取交集处理后，得到两者共同靶点。

2.3 PPI网络构建 在STRING数据库中将共同靶点进行蛋白互作分析，选定物种为“人”，得到靶蛋白互作网络(PPI)，导入Cytoscape 3.6.1软件中，对PPI网络进行拓扑分析，并按degree值分布排列。绘制PPI网络图，根据拓扑分析结果筛选核心靶点，结合TCMSP数据库获取的成分靶点数据，Excel统计核心靶点关联成分，筛选得到核心成分。

2.4 功能与通路富集 基于DAVID、Metascape富集分析工具，选定物种为“人”，进行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。

2.5 中药-成分-靶点-通路构建 将黄芪、山药、葛根、人参成分进行编号，成分对应靶点，核心靶点对应通路，构建网络文件属性文件，导入Cytoscape 3.6.1软件，绘制成分-靶点-通路网络图。

2.6 分子对接 在化学数据库(PubChem)与蛋白质数据库(RCSB-Pdb)中检索核心成分靶点与配体文件，采用Autodock Vina软件对核心成分-靶点进行分子对接。

3 结果

3.1 数据挖掘 在2020年版《中国药典》和药品标准查询数据库中检索到相关处方43首、中药111味，统计使用频数前20的中药，绘制高频中药链接关系网络图(图1)，链接强度为1～17，中药的颜色越红，表明其出现在处方中次数越多；不同中药间的连线越粗，表明两药配伍相关性越强。由此可知，黄芪使用频次最高，其次为天花粉、地黄、麦冬、山药、枸杞子、五味子、知母、葛根、人参，排名前10的配伍药对依次为黄芪-天花粉、黄芪-地黄、黄芪-山药、黄芪-枸杞子、黄芪-葛根、黄芪-麦冬、黄芪-五味子、黄芪-黄精、黄芪-黄连、黄芪-人参。与糖尿病保健食品中排名前十的药食两用中药[4]取交集后，优选出黄芪、山药、葛根、人参。

3.2 作用靶点 在TCMSP数据库中获得黄芪、山药、葛根、人参活性成分共48个，作用靶点92个；在CTD、Gene Cards数据库中获得糖尿病相关靶点共988个，取交集后得到共同靶点56个，成分-疾病靶点见图2。

3.3 PPI蛋白互作图 在Cytoscape 3.6.1中绘制PPI图，并按照重要性排列，按照节点度值(Degree)排序，筛选得到核心靶点，节点颜色越红、越大，表明度值越高，结果见图3。删除与疾病无相关性靶点，得到11个药物-疾病关键靶点，分别为AKT1、PTGS2、MAPK8、IL1B、JUN、CASP3、RELA、ICAM1、STAT1、AHR、NFKBIA，核心成分为槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2，具体见表1。

表1 4味药食两中药核心成分

3.4 GO功能富集 统计生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)，筛选出排名前10者，并绘制GO功能富集分析组图，结果见图4、表2。由此可知，生物过程主要涉及生物过程为对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对细胞外刺激的反应等；分子功能主要涉及核基因编码、蛋白质功能等分子功能；细胞成分主要参与胞浆、核周区、膜区等定位。

表2 GO功能富集分析结果

3.5 KEGG通路富集 主要涉及通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路等，通路气泡富集图见图5，气泡大小代表通路上富集的基因数量，气泡越大，表明富集的基因数目越多；气泡颜色代表-logP值，其值由大到小从红色到蓝色变化。

3.6 成分-靶点-通路构建 通过 Cytoscape 3.6.1软件绘制中药-成分-靶点-通路图，结果见图6。

3.7 分子对接验证 将核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2与AKT1、PTGS2、MAPK8等核心靶点进行分子对接，当结合键能<-5 kcal/mol时，表明两者对接结果良好，采用R语言绘制结合键能热图，见图7，并用Pymol绘制分子对接模型图，见图8～9。

4 讨论

2型糖尿病发病机制复杂，主要为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷[5]。常见降糖药物作用途径单一，并伴有不同程度的副作用，如导致低血糖、乳酸性酸中毒等问题[6]。药食两用中药使用安全，降血糖作用温和持久，兼具降脂、降压、消炎、增强免疫等多种优势[7]，具有治疗2型糖尿病的重大潜能。目前2型糖尿病与低度炎症相关性研究逐渐增多[8]，且肠道菌群失调可能成为重要诱导2型糖尿病发生的因素。

本研究结果表明，黄芪、山药、葛根、人参4味药治疗2型糖尿病的核心靶点为AKT1、PTGS2、MAPK8等。其中，蛋白激酶(AKT)在调节细胞存活，胰岛素信号转导起关键作用，AKT1与胰岛β细胞损伤修复密切相关[9]；前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)参与诱导炎症反应和脂质堆积，能负性调节胰岛素分泌，并与胰岛素敏感性降低相关[10]；丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)作为JNK信号通路重要调控基因[11]，与胰岛素抵抗密切相关。分子对接结果表明，槲皮素、山柰酚与PTGS2结合最稳定，β-谷甾醇、人参皂苷Rh2则与MAPK8结合最稳定，表明4味药核心成分通过作用核心靶点，可能减轻炎症反应，改善胰岛素抵抗来治疗2型糖尿病。

KEGG通路富集分析主要涉及AGE-RAGE、TNF等通路。AGE-RAGE信号通路能够引发一系列炎症，导致胰岛细胞受损和胰岛素抵抗，与2型糖尿病发生密切相关[12]。TNF通路中主要效应分子为肿瘤坏死因子α(TNF-α)，其与肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合，可产生C-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB(NF-κB)等，诱导炎症反应[13]引发胰岛素抵抗。

GO功能富集生物过程涉及脂多糖反应、细菌来源分子反应、细胞外刺激的反应，提示糖尿病的防治可能涉及细菌来源的分子反应，而这与肠道菌群关系密切[14]。研究表明，2型糖尿病可能与肠道菌群变化及其代谢紊乱引起的低度炎症有关[15]。机体正常情况下，以双歧杆菌、乳杆菌为主的益生菌占优，形成菌膜结构，来抵抗病原菌对机体的侵袭[16]。而在2型糖尿病患者肠内，会出现厚壁菌门、变形菌门增多，拟杆菌门、放线菌门减少[17]，以及双歧杆菌和乳酸杆菌减少，肠球菌和大肠杆菌增多[18]等变化。研究表明双歧杆菌能改善高脂饮食小鼠糖耐量，降低TNF-α，IL-6等促炎细胞因子分泌，减轻炎症反应和胰岛素抵抗程度[19]，也可抑制肠道中常见致病菌如拟杆菌等的生长和增殖[20]，发挥调节肠道菌群稳定及抗炎的作用。肠道菌群也能通过微生物代谢物，交叉影响宿主的代谢稳态，从而与2型糖尿病的发病密切相关[21]。脂多糖(LPS)主要来源于革兰氏阴性菌细胞壁。研究发现，2型糖尿病患者肠道内革兰氏阴性菌的比例增加，LPS分泌增多[22]，激活NF-κB通路，促进TNF-α、IL-1β、IL-6等表达[23]，以及促进JNK的激活，从而引发炎症反应。而且已有报道这2种途径均与胰岛素抵抗以及胰岛素信号转导有关[24]。此外，2型糖尿病患者肠道内，SCFAS产生菌尤其是丁酸产生菌会减少[25]，而双歧杆菌作为丁酸盐产生最重要的肠道细菌之一[26]，对促进SCFAS产生、减轻炎症以及降低胰岛素抵抗有积极作用[27]。

多项研究也表明槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2均可抑制NF-κB过度活化，减少LPS诱导的TNF-α、IL-1β等促炎因子的表达，发挥抗炎作用，从而改善胰岛素抵抗与胰岛细胞损伤[28-31]。

综上所述，核心成分槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2，通过作用AKT1、PTGS2、MAPK8等多靶点，参与调控AGE-RAGE、TNF等信号通路表达，可能通过调节肠道菌群失调，改善LPS、SCFAs等代谢途径，共同发挥减轻炎症反应、降低胰岛素抵抗以及减少胰岛β细胞损伤等作用，从而对2型糖尿病起到一定的治疗作用。

5 结论

本研究基于网络药理学与分子对接的分析结果，探讨了成分-肠道菌群-炎症反应-2型糖尿病的关系，提示4味药食两用中药可能通过肠道菌群对2型糖尿病起到一定的治疗作用。本研究基于大数据，借助网络药理学与分子对接的方法初步阐明治疗2型糖尿病机制，其结果仍有待于后续药理实验的验证，并且针对2型糖尿病的不同证型，在中医辨证施治的指导下如何正确使用药食两用药亦是进一步研究的方向。