右归丸中鹿角胶的鉴别

2022-12-04邓杰华李存金周云峰邓见春黄炳泉

中成药 2022年10期

邓杰华，李存金，周云峰，邓见春，吴喆，黄炳泉*

(1.宜春市检验检测中心，江西宜春 336000；2.江西省药品检查员中心，江西南昌 330029；3.高安市人民医院，江西宜春 336000)

右归丸由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、菟丝子、鹿角胶、杜仲、肉桂、当归、制附子组成，具有温补肾阳、填精益髓的功效，主治肾阳不足，命门火衰证，方中附子、肉桂、鹿角胶培补肾中元阳，温里祛寒，共为君药[1]。鹿角胶又称白胶、鹿胶，是由鹿科动物梅花鹿或马鹿等的角经水煎煮[2]、浓缩制成，乃温补肾阳之上品[3]，同时具有抗乳腺增生、抗骨质疏松、活血、镇痛[4-8]等作用。

胶类药材是指由动物的皮、骨骼等加工而成的胶原蛋白水解肽，根据原料来源和功效不同，可分为阿胶、鹿角胶、龟甲胶、黄明胶、海龙胶、新阿胶等[9]，其蛋白质类成分组成较为复杂[4]，对胰蛋白酶消化胶类药材蛋白质产生的肽段进行分析的研究已有报道[9-10]。鹿角胶属于名贵药材，全国需求量大，一些不法商家为节约成本、谋求暴利，会在鹿角胶熬制过程中掺入猪皮、牛皮、驴皮等成分[11-12]，以达到以次充好、以假乱真的目的。右归丸标准未对鹿角胶药材进行质量控制，难以保证鹿角胶投料质量[2]。基于此，拟采用UPLC-MS/MS 技术，建立同时检测右归丸中鹿角胶、猪皮源(新阿胶)、牛皮源(黄明胶)及驴皮源(阿胶)的方法，实现右归丸中同时测定鹿角胶与非法添加成分，以期为右归丸质量标准的提升提供依据和思路。

1 材料

Waters Acquity UPLC H-class/xevo TQD液相色谱质谱联用仪(美国Waters公司)；SPX-150881-II生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；PL-S60超声波清洗仪(东莞康士洁超声波科技有限公司)；MS205DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；TG16-WS离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

右归丸(43批来自市场监督抽样，2批通过网络平台自购)。鹿角胶(批号121694-201702)、阿胶(批号121274-201703)、新阿胶(批号121745-201701)、黄明胶(批号121695-201802)对照药材均购于中国食品药品检定研究院。碳酸氢铵(批号BCBL9865V)、胰蛋白酶(批号SLBZ8570)均购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。乙腈购于德国默克公司；甲酸购于美国赛默飞公司；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法

2.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～1.5 min，5%A；1.5～3.0 min，5%～10%A；3.0～4.0 min，10%～20%A；4.0～5.0 min，20%～60%A；5.0～5.1 min，60%～95%A；5.1～6.5 min，95%A；6.5～6.6 min，95%～5%A；6.6～8.5 min，5%A)；体积流量0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正离子检测，多反应监测(MRM)模式；脱溶剂气温度600 ℃，体积流量1 000 L/h；锥孔气体积流量60 L/h，其他参数见表1。其中，鹿角胶离子对选择参照2020年版《中国药典》[2]鹿角胶鉴别项，黄明胶、阿胶离子对选择参照药品检验补充检验方法和检验项目批准件(编号2014014)[13]，新阿胶离子对选择参照鹿角胶中猪皮源成分检查项补充检验方法(BJY201915)[14]。

表1 各样品质谱参数

2.3 溶液制备

2.3.1 对照药材溶液称取鹿角胶对照药材粉末约0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，0.22 μm水系微孔滤膜滤过，取续滤液10 mL，置于50 mL离心管中，加胰蛋白酶溶液(取胰蛋白酶适量，加1%碳酸氢铵溶液制成每1 mL中含1 mg的溶液，临用现配)1 mL，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，即得。精密称取黄明胶、新阿胶、阿胶对照药材粉末各0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，分别精密量取5 mL，置于同一100 mL量瓶中，加鹿角胶基质溶液(取鹿角胶对照药材粉末约0.1 g，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，即得)稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，置于1.5 mL进样瓶中，加胰蛋白酶溶液100 μL，摇匀，置于37 ℃生化培养箱中恒温酶解12 h，即可。

2.3.2 供试品溶液样品剪细，取约1.5 g(约相当于鹿角胶0.1 g)，精密称定，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，8 000 r/min离心10 min，0.22 μm水系微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL，置于1.5 mL进样瓶中，加胰蛋白酶溶液100 μL，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，即得。

2.3.3 阴性样品溶液取不含鹿角胶的右归丸阴性样品约1.5 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声处理30 min，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，0.22 μm水系微孔滤膜过滤，取续滤液40 mL，置于50 mL离心管中，加胰蛋白酶溶液4 mL，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，即得。

2.3.4 阳性样品溶液取阴性样品约1.5 g，精密称定，加入鹿角胶、黄明胶、新阿胶、阿胶对照药材各0.1 g，按“2.3.3”项下方法制备，即得。

2.3.5 空白溶液取空白样品适量，按“2.3.3”项下方法制备，即得。

2.4 专属性试验取“2.3”项下对照药材、供试品、阴性样品、阳性样品、空白溶液适量，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液出现与鹿角胶对照药材保留时间一致的色谱峰；阳性样品溶液出现与各对照药材相对应的色谱峰；空白溶液对测定无干扰；阴性样品溶液含有1个与阿胶对照药材保留时间一致的色谱峰，但提取相应离子对后未发现上述色谱峰，表明阴性样品、空白溶液均对测定无干扰，该方法专属性良好。

2.5 检出限精密量取“2.3”项下对照药材溶液适量，加阴性样品溶液稀释，当鹿角胶对照溶液稀释5 000倍(相当于称取对照药材0.02 mg)、黄明胶对照溶液稀释1 000倍(相当于称取对照药材0.1 mg)、新阿胶对照溶液稀释1 000倍(相当于称取对照药材0.1 mg)、阿胶对照溶液稀释1 000倍(相当于称取对照药材0.1 mg)时，能检出各成分相应离子对。

2.6 精密度、重复性试验取同一份混合对照药材溶液适量，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得4种胶特征肽的定量离子对峰面积RSD为0.8%～1.4%，表明仪器精密度良好。平行精密称取同一批样品6份，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得鹿角胶、黄明胶、新阿胶、阿胶峰面积RSD分别为2.5%、2.9%、3.2%、2.1%，表明该方法重复性良好。

2.7 样品测定取45批样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，提取各成分离子流图，进行子离子扫描验证，与对照药材溶液进行比较，若供试品溶液出现与各对照药材特征离子对保留时间一致的色谱峰，而且二级质谱基本一致，则可判定该溶液含有相应成分。结果，所有批次样品均检出鹿角胶特征离子对，而猪皮源、牛皮源、驴皮源成分均未检出。

3 讨论

鹿角胶取样量为0.1 g，按照右归丸处方量及制剂工艺计算，样品取样量约为1.5 g；各对照药材在用1%碳酸氢铵溶液溶解定容后，可直接用水膜过滤，而样品属于小蜜丸和大蜜丸，炼蜜含量较高，用1%碳酸氢铵溶液超声提取后，溶液较黏稠浑浊，难以透过0.22 μm水膜，过滤操作困难，需要经过离心使溶液沉淀下沉，选取上清液再进行过滤。另外，当样品与酶的比例为10∶1、酶解时间为12 h时，酶解基本完全，各特征离子的峰面积基本无显著变化。