山楂叶中4种黄酮提取工艺的优化

杜义龙， 田孟尧， 李艳荣， 洪 霞， 赵胜男， 潘海峰

(河北省承德医学院/河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

山楂叶具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的功效[1]，富含黄酮类、多糖类、三萜类等多种化合物，其中黄酮为活性物质[2-6]。以山楂叶黄酮为主要成分的心安胶囊、益心酮片等制剂已广泛应用于临床[7-9]，目前已从中分离鉴定出牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素等成员，具有抗动脉粥样硬化、抗氧化、降血糖等作用[10-15]。本实验采用Box-Behnken响应面法优化山楂叶中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素4种黄酮的提取工艺，以期为该药材开发应用提供参考。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色谱仪(配置四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器、Chemstation色谱工作站，美国Agilent公司)；AG-245型电子分析天平(0.01 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；JA5003型电子天平(1 mg，天津天马衡基仪器有限公司)；KQ-700型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。牡荆素葡萄糖苷(批号20042350)、牡荆素鼠李糖苷(批号18060103)、金丝桃苷(批号19103001)、异槲皮素(批号18062702)对照品均购于成都普菲德生物技术有限公司。山楂叶采自河北省承德市隆化县荒地大后沟村，经承德民族师范学院董建新教授鉴定为正品，标本(编号HBCD-3-11)保存于承德医学院中药研究所。色谱纯乙腈(美国Fisher Scientific公司)；色谱纯甲醇(美国Mreda Technology公司)；分析纯甲酸(美国ROE公司)；分析纯甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为娃哈哈纯净水(天津娃哈哈宏华振饮料有限公司)。

2 方法

2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相0.4%甲酸(A)-乙腈(B)-四氢呋喃(C)，梯度洗脱(0～15 min，5%～7%B，4%C；15～22 min，7%～12%B，4%～2%C；22～30 min，12%～14%B，2%C；30～45 min，14%B，2%C；45～50 min，14%～28%B，2%～4%C；50～55 min，28%B，4%C；55～65 min，28%～85%B，4%C～0)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长350 nm；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷、异槲皮素对照品适量，50%甲醇溶解并定容，即得(四者质量浓度分别为297.4、409.6、255.8、117.6 μg/mL)。

2.3 供试品溶液的制备 取药材粉末(过80目筛)约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min，放冷，60%甲醇补足减失的质量，摇匀，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察 取供试品、对照品、空白溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各黄酮分离度良好，空白无干扰。

2.4.2 线性关系考察 取对照品溶液适量，50%甲醇依次稀释2、4、8、16、32、64、128倍，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表1，可知各黄酮在各自范围内线性关系良好。

表1 各黄酮线性关系

2.4.3 精密度试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各黄酮峰面积RSD均小于3.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批药材6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各黄酮含量RSD均小于3.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各黄酮峰面积RSD均小于3.0%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取6份各黄酮含量已知的药材约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入对照品牡荆素葡萄糖苷1.715 3 mg、牡荆素鼠李糖苷3.078 4 mg、金丝桃苷0.902 41 mg、异槲皮素0.297 62 mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，各黄酮平均加样回收率(RSD)分别为牡荆素葡萄糖苷101.12%(0.77%)、牡荆素鼠李糖苷101.08%(1.5%)、金丝桃苷101.70%(3.7%)、异槲皮素101.11%(2.3%)。

2.5 单因素试验

2.5.1 料液比 取药材粉末6份，每份约1 g，精密称定，分别加入60%甲醇25、50、80、100、150、200 mL，超声提取30 min，自然冷却至室温，60%甲醇补足减失的质量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各黄酮总提取率分别为0.985%、0.993%、0.989%、0.952%、0.950%、0.946%，可知随着料液比增加总提取率呈现先升后降的趋势，在1∶50时达到最大值。因此，选择1∶25、1∶50、1∶80进行后续优化。

2.5.2 甲醇体积分数 取药材粉末4份，每份约1 g，精密称定，分别加入30%、60%、90%、100%甲醇各50 mL，超声提取30 min，自然冷却至室温，相应体积分数甲醇补足减失的质量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各黄酮总提取率分别为0.809%、0.982%、0.888%、0.519%，可知随着甲醇体积分数增加，提取率呈现先升后降的趋势，在60%时达到最大值。因此，选择30%、60%、90%进行后续优化。

2.5.3 超声时间 取药材粉末5份，每份约1 g，精密称定，加入60%甲醇50 mL，分别超声提取20、25、30、35、40、45 min，自然冷却至室温，60%甲醇补足减失的质量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得各黄酮总提取率分别为0.994%、0.995%、1.01%、0.995%、0.955%、0.915%，可知随着超声时间延长，提取率呈现先升后降的趋势，在30 min时达到最大值。因此，选择25、30、35 min进行后续优化。

2.6 Box-Behnken响应面法

在单因素试验基础上，选择超声时间(A)、料液比(B)、甲醇体积分数(C)作为影响因素，每个因素3个水平，各黄酮总提取率(Y)作为评价指标，Box-Behnken响应面法优化提取工艺，结果见表2。

通过Design-Expert12.0软件对表2数据进行多元回归拟合，得方程为Y=1.09+0.000 5A-0.001 9B+0.005 4C+0.006 7AB-0.000 9AC+0.004 5BC-0.010 1A2-0.014 7B2-0.105 5C2，方差分析见表3。由此可知，模型P<0.01，具有高度显著性；失拟项P>0.05，表明结果基本不受未知因素的干扰，模型拟合度良好；决定系数R2为0.966 3，校正决定系数Radj2为0.922 9，表明模型表现出良好的线性关系，可用于响应值预测；变异系数(CV)[16]为1.55%，表明模型方程置信度高，可用于分析响应值变化[17]；各因素影响程度依次为甲醇体积分数>料液比>超声时间。

表2 因素水平、试验设计及结果

表3 方差分析

响应面分析见图2～4，可知在超声时间25～35 min，料液比1∶30～1∶70；或超声时间25～35 min，甲醇体积分数50%～70%；或料液比1∶30～1∶70，甲醇体积分数50%～70%时，各黄酮均可被最大程度地提取出来，即总提取率有相应的最大值，与单因素试验结果一致，并且均不受其他因素的影响，表现为简单非线性关系。

2.7 验证试验 通过Design-Expert 12.0软件，得到最优工艺为超声时间30.038 min，料液比1∶48.193，甲醇体积分数60.722%，各黄酮总提取率为1.086%，根据实际操作的可行性，将其修正为超声时间30 min，料液比1∶50，甲醇体积分数60%。在上述优化工艺下进行3批验证试验，测得总提取率分别为1.135%、1.135%、1.122%，平均值1.130%，与预测值1.086%接近，说明该工艺稳定可行。

3 讨论与结论

指标成分的充分提取是保证中药定量分析准确性的重要前提，影响中药成分提取率的因素较多，提取溶剂的种类及浓度、料液比、提取时间等。本实验对甲醇、乙醇、乙酸乙酯等溶剂进行筛选，结果显示甲醇提取液获得的色谱峰更多、峰面积更大，故选择甲醇作为提取溶剂。

通过对照品比对发现，保留时间为15 min的色谱峰为绿原酸，其分离度好，峰面积大，满足色谱定量的要求，药理作用确切。但料液比考察结果显示，绿原酸提取率随料液比的增加呈现明显下降的趋势，可能该成分是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3个不稳定部分，在提取过程中会因水解和分子内酯基迁移而发生异构化，其结构极不稳定。因此，为提高评价指标的可信度，没有将绿原酸作为定量指标。

综上所述，本实验采用Box-Behnken响应面法优化山楂叶中4种黄酮提取工艺，避免了单一因素评价造成的局限性，也为该药材质量控制研究及功能成的开发提供了科学依据。