RNA聚合酶Ⅱ启动子近端暂停/释放的动态调控及生理作用研究进展

乔朝辉，陈亮

武汉大学生命科学学院，武汉430072

生物体的发育过程中，组织特异性基因在不同细胞中表达以建立不同类型的组织与器官，这一过程需要细胞对基因表达进行精确调控。基因转录是基因表达的第一步，也是细胞分化和响应环境信号的关键调控步骤。真核生物RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase，RNAPⅡ）从结合至基因转录起始位点（transcriptional start site，TSS）到转录结束经历了转录起始、转录起始位点下游近端区域的暂停/释放、在基因体的连续前进与转录、离开转录终止位点后在下游结束转录并脱离基因组DNA等过程［1-3］。这些不同的转录过程涉及不同的调控机制，从而实现对转录的精确调控。真核生物转录调控的研究主要集中在预转录起始复合物（preinitiation complex，PIC）的形成和RNAPⅡ在启动子近端暂停/释放阶段。如果暂停的RNAPⅡ成功进入到转录延伸阶段，即有可能产生有功能的全长mRNA。因此深入了解RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的调控过程至关重要。本文总结了RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的具体分子调控过程，重点综述了RNAPⅡ启动子近端暂停/释放对生物体的发育调控及其与其他基因表达调控机制的偶联，并对RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的研究进行了展望，以期为基因的转录调控提供新的研究方向。

1 RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的调控机制

转录起始后，RNAPⅡ在转录起始点和通用转录因子TFⅡA［RNAPⅡ的转录因子（transcription factor for RNAPⅡ），单独的因子以A、B等加以区分］、TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH及转录中介体复合物等共同组装成PIC启动转录，在新生RNA长度达到9～10个核苷酸后，RNAPⅡ的C末端结构域（C-terminal domain，CTD）Ser5位点发生磷酸化修饰，RNAPⅡ进入启动子下游，并在转录20～60个核苷酸后暂停［4］。RNAPⅡ这种暂停状态的维持和释放受到多种RNA聚合酶辅助因子和转录因子的调控［2］。

1.1 RNAPⅡ启动子近端暂停的维持

RNAPⅡ启动子近端暂停发生在TSS下游，受RNAPⅡ活性位点内的DNA和RNA序列的影响，并主要通过负延伸因子（negative elongation factor，NELF）、DRB敏感性诱导因子（DRB sensitivity inducing factor，DSIF）共同作用来维持［5］。DSIF由SPT4和SPT5两个亚基组成。NELF由4个亚基（NELF-A、NELF-B、NELF-C或NELF-D）和NELFE）组成。在PIC进入TSS下游的暂停区域后，DSIF首先结合到PIC上并替代TFⅡB、TFⅡE、TFⅡF和转录中介体复合物，并进一步募集NELF。结构生物学研究表明，结合在RNAPⅡ上的NELF亚基NELF-A、NELF-E能够与SPT5直接发生接触并使RNAPⅡ中的核酸处于部分易位的状态，阻止新的核苷酸结合［6］。另外，降解NELF并不能释放RNAPⅡ，而是导致其在下游继续暂停并可能提前终止，说明NELF对RNAPⅡ在正确位置暂停的维持发挥重要作用［7］。NELF和DSIF与RNAPⅡ的结合稳定了暂停的RNAPⅡ构象，抑制了TFⅡS和RNAPⅡ相关因子1复合物（RNAPⅡassociated factor complex，PAF1C）的结合，从而阻止了转录延伸复合物的组装。但是NELF和DSIF与RNAPⅡ结合导致启动子近端暂停的具体机制尚不完全清楚。

越来越多的蛋白被发现在维持RNAPⅡ启动子近端暂停中发挥作用，如Gdown1蛋白通过结合RNAPⅡ阻断其与TFⅡF的结合，从而稳定转录暂停［8］。GAGA因子是序列特异性的DNA结合因子，能够将NELF募集至启动子附近促进NELF和RNAPⅡ结合［9］。PAF1C参与启动子近端暂停，但其作用存在争议。有报道认为，PAF1C通过抑制超级延伸复合物（super elongation complex，SEC）与基因的互作来加强暂停［10］。但也有研究表明，PAF1C可通过将P-TEFb引入暂停延伸复合物来刺激暂停释放［11］。TFⅡD也是建立RNAPⅡ启动子近端暂停所必需的，其TAF1和TAF2亚基的耗竭导致RNAPⅡ启动子近端的释放和转录重新启动。另外RNAPⅡ与PIC，特别是TFⅡD的相互作用可以导致其暂停，这说明NELF和DSIF并非RNAPⅡ启动子近端暂停所必需的［12］。

1.2 RNAPⅡ从启动子近端暂停中释放的调控

处于转录暂停阶段的RNAPⅡ在进入基因体之前会发生一系列分子事件，完成转录起始复合物到转录延伸复合物的转变。参与RNAPⅡ释放的蛋白主要包括正转录延伸因子b（positive transcription elongation factor b，P-TEFb）、CDK8-中介体、溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）等。在哺乳动物细胞中，P-TEFb是由催化亚基细胞周期依赖性激酶9（cyclin dependent kinase 9，CDK9）和调节亚基细胞周期蛋白T1/2（cyclin T1/2）组成的异源二聚体，主要与7SK核内小核糖核蛋白（7SK small nuclear ribonucleoprotein，7SK snRNP）转录抑制复合物在启动子近端区域和增强子处结合，从而处于非活性状态［13］。目前研究已表明存在多种机制促进P-TEFb的释放及激活，如在应激情况下，蛋白磷酸酶PP2B和PP1α信号通路激活，P-TEFb从7SK snRNP中释放。激活的PP1α信号通路与Ⅰ类组蛋白脱乙酰酶HDAC1/2/3（class I histone deacetylase 1/2/3，）共同作用，实现H3S10ph的去磷酸化，释放染色质结合的BRD4、BRD4和SEC实现PTEFb从7SK snRNP中的解离和激活，促进RNAPⅡ的释放［14］。研究表明SR-剪接因子SRSF2和DEAD-box RNA解旋酶DDX21等涉及这个过程［15-16］，BRD4也 能 独 立 于P-TEFb促 进 转 录 延伸［17］。活性状态的P-TEFb能够实现对RNAPⅡ的CTD结构域Ser2与NELF及DSIF的磷酸化，促进RNAPⅡ释放并进入转录延伸。磷酸化后的NELF解离并允许NTPs加入RNAPⅡ，而DSIF被磷酸化后则对转录延伸起促进作用。另外RNAPⅡ的CTD结构域Ser2的磷酸化能够募集其他延伸因子组装SEC［18］。

RNAPⅡ从启动子近端释放还有其他多种蛋白的参与。TFⅡS帮助启动子近端RNAPⅡ释放并使其处于快速响应状态［19］。TFⅡD也能将P-TEFb募集至SEC，使RNAPⅡ进入延伸状态［20］。这与TFⅡD维持RNAPⅡ暂停的结论相反，但其具体机制有待进一步解析。转录因子MYC也被证明可促进RNAPⅡ在启动子近端的释放［21］。抑制CDK8-中介体增加RNAPⅡ暂停，提示其在启动子近端暂停的调控中发挥作用［22］。研究表明中介体通过与BRD4互作招募P-TEFb［23］。TRIM28之前被认为可稳定RNAPⅡ在蛋白质编码基因中的停顿，近年来的研究则发现其有双向特性：在非诱导状态下抑制转录，而在转录激活中起正调节转录延伸的作用［24-25］。免疫共沉淀实验证明，NF-κB、CⅡTA和AIRE等转录因子能够直接与P-TEFb发生互作，并被认为在P-TEFb募集中发挥作用［26-28］。启动子近端暂停和众多调控蛋白之间的互作正逐渐被了解，但这些因子在RNAPⅡ-DSIF-NELF复合物中的具体功能仍有待更深入的研究。

2 RNAPⅡ启动子近端暂停/释放在机体发育中的作用

RNAPⅡ启动子近端暂停/释放在物种间较为保守，细胞与动物模型研究特别是早期以果蝇模型为代表的发育研究在RNAPⅡ暂停的现象与功能解析方面做出了重要贡献。RNAPⅡ在启动子下游暂停的现象最初在果蝇HSP70基因中发现，如TFⅡS、NELF和DSIF等多个蛋白在RNAPⅡ启动子近端暂停中的作用在果蝇中得到证实［29］。果蝇胚胎ChIP-chip分析结果表明，有至少12%的基因在转录起始点附近出现了RNAPⅡ积累，而在发育不同阶段RNAPⅡ的累积/暂停可能在不同基因的TSS处呈现动 态 变化［30］。ChIP-seq数据显示，RNAPⅡ被募集至发育基因的启动子处并处于暂停状态以备激活表达，而成体组织特异性基因的RNAPⅡ暂停程度较小，并且倾向于由含有TATA box的启动子驱动［31］。

生物体的发育过程需要通过RNAPⅡ启动子近端暂停使细胞群体以精确和同步的方式对细胞外信号作出快速反应，由此作为组织器官生成的基础，驱动细胞类型的多样化。在果蝇早期胚胎发育的中囊胚转换（mid-blastula transition，MBT）阶段，RNAPⅡ启动子近端暂停介导的转录同步激活有助于实现精确的转录时空调控和发育中复杂遗传程序的有序展开［32-33］。在特定时空的发育信号激活下，相关区域特定基因上暂停的RNAPⅡ随即进入释放状态，实现同步转录，如在由DPP激活的背外胚层形成和由Snail激活的中胚层形成过程中，广泛存在的RNAPⅡ启动子近端暂停能够实现对应部位基因的快速同步启动，从而实现背腹侧体轴的形成［30］。而SPT5突变会导致果蝇体轴发育缺陷［34］。NELF通过阻止发育基因的异常表达，并可能通过与其他在胚胎干细胞维持中起关键作用的转录抑制蛋白相互作用来抑制转录，帮助维持胚胎干细胞的未分化状态。果蝇胚胎发育早期的NELF缺失导致胚胎转录激活失败，并在MBT和原肠胚形成前死亡［35］。研究表明，NELF突变的小鼠胚胎干细胞对分化信号的反应减弱［36］，NELF突变的小鼠胚胎也无法发育到妊娠中期［37］；同时机体可以通过调节NELF蛋白丰度来控制细胞分化。NELF的过表达严重阻断造血干细胞的分化，其缺失则会导致粒细胞分化程序的过早激活［38］。另外研究表明，斑马鱼中SPT5的缺失导致其在发育第4天死亡［39］，说明对RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的负调控而非正调节对于机体发育至关重要。以上结果表明，RNAPⅡ启动子近端暂停在细胞命运决定乃至机体发育中发挥重要调控作用。

3 RNAPⅡ启动子近端暂停与其他基因表达调控机制的偶联

3.1 染色质可及性和表观修饰

RNAPⅡ启动子近端暂停影响核小体修饰并调控染色质的可及性。在暂停RNAPⅡ的CTD结构域的Ser5实现磷酸化修饰之后，SET被募集至RNAPⅡ并完成H3K4 me3修饰，这又会促进H3K9乙酰化，并通过SEC的募集来促进转录延伸［40］。此外组蛋白去乙酰化酶SIRT6可以去除H3K9ac标记，稳定暂停的RNAPⅡ复合物，并通过调控P-TEFb和SEC组装降低靶基因表达［41］。在果蝇细胞中通过Trichostatin A对组蛋白进行去乙酰化修饰也会导致RNAPⅡ启动子近端的释放［42］。以上结果说明暂停复合物与其他染色质相关因子及组蛋白修饰之间存在复杂关联，证明RNAPⅡ启动子近端暂停是一种环境依赖的基因转录调控途径。

果蝇胚胎发育过程中，许多启动子处的核小体结合较强，随时间推移逐渐开放并获得高度停顿的RNAPⅡ，使基因处于易于对细胞外的信号做出反应的状态［30］。当细胞未收到激活信号时，转录抑制因子通常会使RNAPⅡ暂停的基因保持沉默。Polycomb蛋白复合物（polycomb group，PcG）常结合于发育控制基因上，以时空调控方式对核小体进行H3K27 me3修饰，防止发育基因错误表达。在果蝇发育中，同时被暂停的RNAPⅡ占据和PcG蛋白抑制的基因常处于表达的动态调控过程，激活和抑制之间的动态平衡使基因处于可诱导状态。

3.2 RNA剪切和提前终止

启动子近端的转录提前终止是机体常见的基因调控方式。整合因子复合体（integrator complex）在启动子近端发生转录提前终止发挥重要作用。一方面，整合因子复合体与NELF和DSIF相互作用，介导启动子下游新生RNA的切割及降解；另一方面，整合因子复合体通过招募丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A复合物驱动暂停RNAPⅡ的CTD去磷酸化，从而抵消CDK9活性和相关暂停释放［43］。尽管关于整合因子复合体介导的启动子近端转录提前终止的具体机制尚不明确，但这些发现表明任何给定基因的转录都可以通过相反的激酶和磷酸酶活性进行微调，并分别驱动RNAPⅡ启动子近端释放或提前终止。

3.3 RNAPⅡ启动子近端暂停与R环之间的联系

RNAPⅡ启动子近端暂停能够促进新生RNA与模板DNA互补配对形成R环，而当RNAPⅡ的CTD区域发生ser2的磷酸化修饰后，RNAPⅡ进入延伸状态并导致R环水平下降，此外，易于发生RNAPⅡ暂停的启动子区域富含GC，而非编码链上的GC，特别是G富集序列易形成G-四联体（Gquadruplex）结构从而进一步稳定R环［44］。全基因组研究也证实，R环富集于RNAPⅡ暂停且富含GC的TSS区［45］。另外NELF-B突变介导的RNAPⅡ暂停的衰减可以降低R环的积累［46］。SRSF2能够从7SK复合物中释放p-TEFb，SRSF2的活性丧失导致暂停释放受损并进一步促进R环的形成［47］。在果蝇组织中R环富集于TSS区域，并在衰老过程中的下调基因上广泛富集，而破坏R环的动态平衡则会增加神经退行性病变的风险［48］。在果蝇胚胎发育中，PcG能够通过诱导HOX基因处R环的形成来阻止转录延伸向下进行，从而达到调控发育的目的［49］，暗示RNAPⅡ启动子近端暂停和R环调控存在联系。以上研究表明，RNAPⅡ启动子近端暂停与其他基因表达调控机制偶联形成复杂的调控网络，共同调控基因表达及发育过程。

4 展望

RNAPⅡ启动子近端暂停/释放是基因表达调控的关键步骤，充分了解参与暂停释放调控的蛋白因子和调控机制十分具有挑战性。已有研究为RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的分子机制解析提供了一个总体框架。新的调控因子不断被发现，各因子调控基因的特异性以及相互协作机制逐渐被研究清楚。但是目前对RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的研究主要是通过敲除或过表达调控因子实现，而特异性靶向RNAPⅡ暂停因子进行敲除或过表达需要数小时至数天，研究结果很有可能混淆了该基因敲除/过表达后的次级效应。因此使用靶向蛋白快速降解系统研究候选蛋白的调控作用十分必要。在复杂的机体调控过程中，RNAPⅡ启动子近端暂停与其他转录调控步骤相互依赖，与其他染色质相关因子和组蛋白修饰互作调控，从而形成复杂的调控网络，而该网络的系统性解析对研究者提出了更高要求，RNAPⅡ启动子近端暂停与其他基因表达调控机制的偶联也需要进一步深入研究。系统解析发育及其他生物过程中，R环与RNAPⅡ的动态偶联机制也将为全面揭示RNAPⅡ启动子近端暂停/释放的生理意义提供新的研究方向。