NCBP2基因在人神经胶质瘤中的表达与调节细胞凋亡的机制研究

吴鹏，薄威，郭丽，祁荣，王一维

（1.沈阳医学院基础医学院科学实验中心，辽宁 沈阳 110034；2.病理学教研室；3.人体解剖学教研室）

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，约占中枢神经系统（CNS）肿瘤的80%［1］。根据世界卫生组织（WHO）的CNS肿瘤分级，将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级。其中Ⅳ级胶质瘤最为常见并且侵袭性最强，又被称为胶质母细胞瘤（glioblastomas，GBM）［2］。尽管临床手术、放疗和传统化疗取得了进展，GBM的预后仍然很差，中位生存期为14～16个月。低级别胶质瘤（low-grade gliomas，LGG）（WHOⅡ级）患者，尽管生存期可能超过10年，但预后仍不理想，因为这些肿瘤最终将发展为高级别胶质瘤（high-grade gliomas，HGG）（WHOⅢ或Ⅳ级）［3］。核帽结合蛋白亚基2（nuclear cap binding protein subunit 2，NCBP2）也称为帽结合蛋白复合体2（cap-binding protein complex，CBC2）。有研究表明NCBP2以癌基因的表现存在于部分肿瘤之中，已被证实为卵巢癌的关键靶基因，并且在肺腺癌与肺鳞癌中表达上调［4］。NCBP2在人胶质瘤中表达情况鲜见报道，本研究拟探讨NCBP2基因在人胶质瘤中的表达及调节细胞凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞U87（上海中国科学院细胞库）；shRNA慢病毒质粒（上海GeneChem公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒与TUNEL凋亡试剂盒（武汉伊莱瑞特生物公司）；兔抗人NCBP2多克隆抗体与β-actin多克隆抗体（美国Abcam公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；凋亡流式检测试剂盒（江苏凯基生物有限公司）。BD Accuri C6 Plus流式细胞仪（美国BD公司）；ECLIPSE Ni-U光学显微镜（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1NCBP2在泛癌中的表达水平和在HGG、LGG及其亚型中的表达 利用GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）基因表达谱交互式分析平台（http://gepia.cancer-pku.cn），分析NCBP2在泛癌中的表达水平和在HGG、LGG及其亚型中的表达情况。利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库获取胶质瘤LGG/GBM数据，分析NCBP2基因的表达差异并绘制受试者工作特征（ROC）曲线。

1.2.2 细胞培养与转染 将U87细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO237℃。在shRNA慢病毒质粒进行转染，并用嘌呤霉素进行筛选。

1.2.3 Western blot实验 刮取细胞，放入蛋白裂解液中2 h，提取总蛋白。用BCA试剂盒定量，测定浓度。样品（20μg蛋白）经10%分离胶电泳后，转膜。在用封闭液封闭1 h后，一抗孵育4℃过夜，二抗孵育37℃2 h，并通过ECL化学发光显影。

1.2.4 MTT实验 以3 000个细胞/孔的密度接种在6孔板中。在0、24、48和72 h时间点给予MTT溶液处理。孵育2 h后，将MTT溶液换成二甲基亚砜，在490 nm处测量每个孔的光密度。重复3次。

1.2.5 集落形成试验 将U87细胞接种在6孔板（500～1 000个细胞/孔）中培养13 d。细胞用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色。平板成像、菌落计数和统计分析。重复3次。

1.2.6 Transwell实验 将U87细胞培养至对数生长期，用磷酸盐缓冲液和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度。在下室加入600～800μl含10%胎牛血清的培养基，上室加入100～150μl细胞悬液（上室铺胶为侵袭实验），培养24 h。取出小室，甲醇固定，加入Giemsa染液。用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞。显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。重复3次。

1.2.7 TUNEL凋亡实验 在96孔板中接种细胞，待细胞贴壁后，培养24 h，用4%多聚甲醛室温下固定后，用磷酸盐缓冲液、蒸馏水洗涤。用TrionX-100通透，洗涤后加入平衡缓冲液、核苷混合物和重组末端脱氧核苷酸转移酶，37℃避光孵育2 h，洗涤后，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，荧光显微镜下观察。重复3次。

1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 将U87细胞（1×105个细胞/孔）接种于6孔板中并培养细胞，转染后24 h；对照细胞为转染空载后24 h。然后收集细胞，用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行染色，随后用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，组间比较采用Mann-WhitneyU检验或One-way ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NCBP2在胶质瘤中的表达上调 GEPIA可视化平台分析了NCBP2在泛癌中的表达，结果发现NCBP2基因在LGG、GBM中表达显著高于正常脑组织，见图1A与B。提取TCGA的胶质瘤（689例）和GTEx中的正常组织（1 157例）数据，通过统计分析发现NCBP2基因在胶质瘤中表达上调，见图1C。ROC曲线发现，NCBP2 mRNA表达水平能准确区分肿瘤与非肿瘤组织样本，见图1D。

图1 NCBP2在胶质瘤中的表达上调

2.2NCBP2在胶质瘤亚型中的表达升高 利用GEPIA可视化平台分别比较LGG亚型中星形细胞瘤型（98例）、少星形细胞瘤型（76例）和少突胶质细胞瘤型（116例）与正常脑组织（207例）中NCBP2的表达，结果显示其在肿瘤组织中表达均升高，见图2A。分别比较GBM的亚型中经典型（40例）、间充质型（55例）、神经元型（28例）和前神经型（37例）与正常脑组织（207例）中NCBP2的表达，结果显示除神经元型外，NCBP2在其他亚型中表达均升高，见图2B。

图2 NCBP2在LGG亚型与GBM亚型中的表达

2.3 下调NCBP2基因抑制胶质瘤细胞的增殖能力为防止基因沉默的脱靶效应，我们设计了2个shRNA序列（shRNA#1、shRNA#2），通过Western blot法检测转染效率，显示这2组U87细胞中NCBP2的蛋白表达均降低，见图3A；MTT生长曲线发现沉默组U87细胞的增殖能力显著下调，见图3B；平板克隆形成实验结果显示沉默组U87细胞的克隆形成能力明显受到抑制，见图3C。

图3 沉默NCBP2基因抑制胶质瘤细胞增殖能力

2.4 下调NCBP2基因抑制胶质瘤细胞侵袭与迁移能力 Transwell侵袭与迁移实验结果显示，与shNC组比较，沉默NCBP2组（shRNA#1与shRNA#2）迁移与侵袭的细胞数量显著下调，见图4。

图4 沉默NCBP2基因抑制胶质瘤细胞侵袭与迁移能力

2.5 TUNEL染色检测细胞凋亡 TUNEL染色检测结果发现，shNC组细胞几乎不存在TUNEL阳性细胞，在沉默NCBP2基因组（shRNA#1与shRNA#2）中可以观察到高比例的凋亡阳性细胞，见图5。

图5 TUNEL染色检测细胞凋亡水平

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 流式凋亡实验检测结果发现，在人胶质瘤细胞U87中沉默NCBP2基因导致细胞凋亡率显著升高，见图6A和B；进一步通过Western blot结果显示NCBP2基因沉默组Cleaved-PARP与Cleaved-caspase 3蛋白表达上调而Bcl-2蛋白表达下调，见图6C。

图6 沉默NCBP2诱导胶质瘤细胞凋亡

3 讨论

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，其恶性程度高，预后差［5-6］。尽管有标准的治疗方案，包括手术后放疗和化疗，胶质瘤患者的预后仍然很差［7-8］。其中GBM是最具侵袭性的类型，肿瘤的异质性是GBM最重要的标志之一，导致治疗抵抗和肿瘤复发［9］。因此，想要有针对性地提高GBM患者的预后，应用个性化的治疗策略尤为关键。CBC是NCBP1和NCBP2组成的异二聚体复合物［10］。当NCBP2直接结合mRNA的帽状结构时，随后NCBP1可以招募mRNA成熟所需的细胞因子，这样保护了RNA聚合酶在转录过程中不被降解。CBC在mRNA从细胞核输出到细胞质、mRNA的剪接及成熟等多方面功能中起重要作用［11］。

在本研究中，为明确NCBP2基因在胶质瘤中的表达，我们首先使用GEPIA可视化平台分析发现NCBP2在LGG与GBM中表达上调。为进一步证实该基因在胶质瘤中的表达差异及临床意义，我们从公开的TCGA数据库中下载了689例样本的基因表达信息及临床资料、GTEx数据库中1 157例正常样本，通过统计分析显示NCBP2基因在胶质瘤中表达上调；更值得关注的是ROC分析发现NCBP2是胶质瘤诊断的潜在生物学标志物。在果蝇的研究中发现，NCBP2的同源基因被敲除后能够破坏神经细胞的增殖能力［10］。我们应用基因沉默技术，在人胶质瘤细胞U87中下调NCBP2基因，并通过Western blot检测转染效率，应用MTT实验、克隆形成实验与Transwell侵袭与迁移发现沉默NCBP2基因抑制人胶质瘤细胞增殖、侵袭与迁移能力。

细胞凋亡是一种细胞程序性死亡的过程，其特征是染色质浓缩、核碎裂、凋亡小体的形成、ROS水平的增加和caspases的激活，死亡受体途径（外源性途径）和线粒体凋亡途径（内源性途径）是导致细胞凋亡的2条主要途径［12］。本研究发现，沉默NCBP2基因能够促进人胶质瘤细胞的凋亡。Bcl-2是一种重要的癌基因，在细胞凋亡中起重要作用。Bcl-2蛋白家族主要调控细胞［13］。我们应用Annexin V-FITC和PI双染色，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况，NCBP2基因表达下调组U87细胞凋亡率明显上升，同时通过Western blot法结果显示沉默NCBP2组细胞Cleaved-PARP与Cleavedcaspases 3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达下调。

综上所述，本研究首次通过生物信息学，利用多种数据库及可视化平台分析了人类胶质瘤中NCBP2的表达情况，及该基因在胶质瘤中表达的重要意义。并且通过实验验证，沉默NCBP2基因后可以抑制人胶质瘤细胞U87的恶性生物学进程，并且诱导细胞的凋亡。