团头鲂咽齿发育相关基因系统进化及其表达分析

朱德杰，吴亚明，陈宇龙，高泽霞，2

1.华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁育重点实验室/农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/湖北省名优鱼育种与健康养殖工程技术研究中心/长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，武汉 430070；2.湖北洪山实验室，武汉 430070

分泌型钙结合磷蛋白（secretory calciumbinding phosphoprotein，SCPP）基因家族编码的多种磷酸蛋白参与骨的骨化[1-2］，在哺乳动物骨骼、牙釉质和牙本质的形成中发挥着重要作用[3-4］。咽齿的出现是脊椎动物进化的一种方式，根据其大小、形状、数量和位置的差异，在脊椎动物分类群中呈现多样性[5］。咽齿属于骨骼系统的一部分，在形成过程中涉及到矿化，这些矿化组织的形成涉及多种因素，其中就包括一些关键基因，如分泌型钙结合磷蛋白SCPP家族基因[1］。鱼类基因组中确定了13 个SCPP 家族基因，且这些SCPP 家族基因都来自同一个祖先spar⁃cl1（the secreted protein acidic cysteine-rich like 1）基因。SCPPs可分为2个亚类：含有大于25%Glu、Asp和磷酸化Ser 残基的酸性SCPP 以及含有大于20%Pro 和Gln 的富含Pro/Gln（P/Q）的SCPP[2］。在哺乳动物中，酸性SCPP 主要与骨和牙本质矿化有关，而富含P/Q的SCPP可使釉质矿化[6］。

鱼类已有SCPP 家族基因研究主要集中于从基因组水平比较基因序列的差异，这些差异可能与矿化组织的表型转化有关[7］。Venkatesh 等[8］在软骨鱼类象鲨（Callorhinchus milii）的基因组中只发现了2个与SCPP 相关的祖先基因（即sparc和sparcl1）。Laue 等[9］发现斑马鱼（Danio rerio）SCPP 家族基因组中spp1基因的靶向突变导致骨形成减少。Lin等[10］在虎尾海马（Hippocampus comes）中发现了2 个酸性SCPP 基因（scpp1和spp1），但与牙本质和釉质样矿化有关的P/Q 丰富的基因如amel、enam、ambn和odam等在基因组中完全缺失。

团头鲂（Megalobrama amblycephala）又名武昌鱼，是我国特有的草食性经济鱼类之一，具有营养价值高、生长较快、存活率高和易捕捞等特点，华中农业大学王卫民、高泽霞团队针对其种质资源保护及遗传改良方向进行了相关研究[11-12］。目前关于团头鲂咽齿方面的研究还较少，本研究通过全基因组Blast 获得了团头鲂咽齿发育相关基因fa93e10（enam）、scpp1、scpp6（ambn）、scpp9、odam和spp1的序列信息，并分析其在团头鲂不同组织和咽齿关键发育时期的表达情况，以期为了解鱼类咽齿发生发育分子机制提供一定的基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用团头鲂均来自湖北省阳新县百容水产良种有限公司（湖北省黄石市阳新县浮屠镇）。试验共采集3 尾1 龄团头鲂第五鳃弓（含咽齿）、第四鳃弓（不含咽齿）、肌间刺、大脑、鳍条、心脏、肝脏、脾脏、肌肉、肋骨10 种组织样品，每个组织3 个样品。同时，分别采集鱼苗孵出后9、18、27、36、45、54 d 团头鲂的第五和第四鳃弓，每个阶段3 个重复样品。所有采样用鱼使用MS-222 麻醉后进行采样，样品采集完成后置于液氮中速冻后，转入−80 ℃冰箱保存、备用。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

取−80 ℃冻存的9~54 d 团头鲂第四、第五鳃弓及1 龄团头鲂10 种组织样品，用Trizol 法（TAKA⁃RA，大连）提取总RNA 并电泳检测完整性，Nano⁃Drop ND-2000 核酸蛋白仪（Thermo，美国）测定RNA 浓度及OD 值。按照HiScript®ⅡQ RT Super⁃Mix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒（Vazyme，南京）的说明书合成各样品的cDNA，将合成的cDNA稀释5倍后，置于−20 ℃冰箱保存。

1.3 基因克隆

Ensembl 网站上下载斑马鱼enam（ENSD⁃ART00000132089.3）、scpp1（ENSDART00000127579.3）、ambn（ENSDART00000121605.4） 、scpp9（ENSD⁃ART00000129813.2）、odam（ENSDART00000137646.3）和spp1（ENSDART00000101261.6）的cDNA 序列，与团头鲂的全基因组序列[13］（BioprojectID：PRJNA343584）进行Blast比对，获得团头鲂enam（NP_14992）、scpp1（NP_15021）、ambn（NP_15032）、scpp9（NP_14953）、odam（NP_15082）和spp1（NP_25259）的完整CDS 序列。利用Primer Premier5.0软件进行引物设计，由北京擎科生物科技有限公司武汉分公司合成，以转录的cDNA 为模板进行PCR 扩增。用1%琼脂糖检测产物质量后，将条带单一的PCR 产物送武汉擎科生物科技有限公司测序。将测序获得的目的基因片段与已知片段比对拼接，获得团头鲂上述6个基因的完整CDS序列。

1.4 基因生物信息学分析

利用NCBI 的ORF finder 程 序（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析基因开放阅读框；使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析6个SCPP家族基因的理化性质。使用DNAMAN软件对不同脊椎动物6 个SCPP 家族基因进行同源性分析，并使用MEGA7.0 软件构建基因系统进化树。进化树各基因物种信息如下：

enam：人（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、小鼠（Mus musculus）、半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）、鲤（Cyprinus carpio）、斑马鱼（Danio rerio）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、雀鳝（Lepisosteus oculatus）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）、青鳉（Oryzias latipes）、牙 鲆（Paralichthys olivaceus）、秀 美 花 鳉（Poecilia formosa）；

scpp1：半滑舌鳎、斑马鱼、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）、大黄鱼、雀鳝、团头鲂、青鳉、牙鲆、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）；

ambn：人、牛、斑马鱼、雀鳝、团头鲂、小鼠；

scpp9：雀鳝、鲤、斑马鱼、团头鲂、青鳉、秀美花鳉；

odam：人、牛、小鼠、半滑舌鳎、鲤、斑马鱼、斑点叉尾鮰、大黄鱼、团头鲂、黄鳝（Monopterus albus）、青鳉、牙鲆、秀美花鳉、红鳍东方鲀；

spp1：人、牛、半滑舌鳎、斑马鱼、斑点叉尾鮰、大黄鱼、雀鳝、团头鲂、小鼠、青鳉、牙鲆、秀美花鳉、红鳍东方鲀。

1.5 qRT-PCR基因定量分析

参照Blast 获得的6 个基因的序列信息，以βactin为内参，利用NCBI 网站的Primer-Blast 设计其定量引物。由武汉擎科公司合成（表1）。荧光定量PCR 使用Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix（Low Rox）试剂盒（YEASEN，上海），以团头鲂咽齿发育关键时期1 龄团头鲂不同组织样品cDNA 为模板，参照试剂盒说明书进行qRT-PCR 反应。采用2-△△Ct法计算目的基因的mRNA 相对表达量。使用SPSS 软件中的Duncan’s Multiple Range Test 比较基因在咽齿发育关键时期及不同组织中的相对表达水平差异性。

2 结果与分析

2.1 SCPP家族基因理化性质分析

利用Blast 获得了团头鲂SCPP 基因家族6 个咽齿发育相关基因的cDNA 核心序列，根据ProtParam软件预测结果显示各基因的理化性质如表2所示，其中enam的分子式为C1106H1709N281O357S6，氨基酸残基中Ala（A）、Pro（P）、Val（V）、Glu（E）的频率较高。scpp1的分子式为C1107H1746N306O457S8，氨基酸残基中Ser（S）、Glu（E）、Asp（D）、Thr（T）的频率较高。ambn的分子式为C1511H2333N415O448S13，氨基酸残基中Pro（P）、Val（V）、Gln（Q）、Ser（S）的频率较高。scpp9的分子式为C1580H2432N420O444S4，氨基酸残基中Pro（P）、Gln（Q）、Gly（G）、Leu（L）的频率较高。odam的分子式为C3441H5366N918O1026S30，氨基酸残基中Pro（P）、Leu（L）、Val（V）、Gly（G）的频率较高。spp1的分子式为C1615H2561N435O635S8，氨基酸残基中Ser（S）、Glu（E）、Thr（T）、Ala（A）的频率较高。

表2 团头鲂SCPP家族基因的理化性质Table 2 Physical and chemical properties of SCPP family genes in M.amblycephala

2.2 SCPP家族基因同源性分析

使用DNAman 软件对人、鼠、牛、团头鲂及其他鱼类enam、scpp1、ambn、scpp9、odam与spp1编码的氨基酸序列进行同源性比较，并使用MEGA 软件构建进化树。结果显示，团头鲂enam编码的氨基酸序列与斑马鱼（16.47%）、鲤（13.56%）具有相对较高的同源性（图1），在进化树中距离最近（图2）；与其他鱼类同源性相对较低（1.53%~9.62%）；与人（0.61%）、鼠（0.78%）、牛（0.70%）具有极低同源性；在进化树中鱼类与哺乳类和家禽类的遗传距离比较远，形成2个大分支。与团头鲂其他5 个基因同源性最高的也都是斑马鱼（图1），进化树中距离较近，其中odam和scpp9在进化树中距离最近的物种为鲤（图2），与其他物种的同源性较低。除此以外我们发现同样是SCPP 家族基因，团头鲂enam和scpp9编码的氨基酸序列与斑点雀鳝同源性较低，分别为1.53% 和4.38%（图1），但在scpp1、ambn和spp1这3 个基因与斑点雀鳝的同源性相对较高，分别为16.38%、12.95%和20.25%（图1）。通过比对不同脊椎动物enam与odam这2 个基因编码的氨基酸序列，发现在鱼类中均存在这两段氨基酸序列的缺失（图3）。

图1 团头鲂SCPP家族基因与其他脊椎动物基因的同源性比较Fig.1 Comparison of homology between SCPP family genes of M.amblycephala and genes of other vertebrates

图2 团头鲂SCPP家族基因与其他脊椎动物基因的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of SCPP family genes between M.amblycephala and other vertebrates

图3 不同脊椎动物enam和odam部分编码序列比对分析Fig.3 Partial alignment sequences of enam and odam in the different vertebrates

2.3 SCPP家族基因在不同组织的表达分析

采用qRT-PCR 方法分析1 龄团头鲂enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1在不同组织中的表达情况，结果（图4）显示：enam、scpp1、ambn、scpp9和spp1基因在第五鳃弓和肋骨中具有较高的表达量，与其他组织中的表达水平大多存在显著性差异（P<0.05），且在第四鳃弓中的表达量极低（图4A-D、F）。odam基因仅在肋骨里面有很高的表达量，与其他所有组织的表达水平均存在显著性差异（P<0.05）（图4E）。enam和scpp1基因在脑中的表达量比在肌间骨中高，但相较于第五鳃弓和肋骨仍存在显著性差异（P<0.05）（图4A-B）。ambn、scpp9、odam和spp1在脑中的表达量则显著低于第四、第五鳃弓、肌间骨以及肋骨（P<0.05）（图4C-F）。enam、scpp1、ambn、scpp9和spp1基因在肌间骨中也存在着近似的表达模式，表达量相较于第五鳃弓明显降低且有显著性差异（P<0.05），但相较于第四鳃弓表达量还是有所上升（图4A-D、F）。enam、scpp1、ambn和spp1基因在鳍条中也具有较高的表达量（图4A-C、F），且enam、ambn和spp1基因在鳍条中的表达量高于在第四鳃弓中的表达量，且存在显著性差异（P<0.05）（图4A、C、F）。enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在心脏、肝、脾和肌肉中的表达量相较于其他组织均较低，且存在显著性差异（P<0.05）（图4A-F）。

图4 团头鲂SCPP家族基因在不同组织的相对表达量Fig.4 Relative expression of SCPP family genes in the different tissues of M.amblycephala

2.4 SCPP 家族基因在早期咽齿发育阶段的表达分析

基因表达分析结果如图5 所示。enam基因于鱼苗孵出后第9、18、27 天在第四鳃弓与第五鳃弓的表达量相近，无显著性差异，第36、45 和54 天在第五鳃弓表达量显著高于第四鳃弓（P<0.05）（图5A）。scpp1基因在第9、18、27 天第五鳃弓表达量略高于第四鳃弓，在第36、45 和54 天第四鳃弓中的表达量高于第五鳃弓（图5B）。ambn基因在第9~54天第五鳃弓中的表达量均大于第四鳃弓，其中第9 天第四、第五鳃弓中的表达量无显著性差异，在第54 天第五鳃弓中的表达量显著高于第四鳃弓（P<0.05）（图5C）。scpp9基因在第9~54 天第五鳃弓中的表达量均大于第四鳃弓，且具有显著性差异（P<0.05）（图5D）。odam基因在第9 天第五鳃弓表达量略高于第四鳃弓，第18 天第四鳃弓表达量高于第五鳃弓，在第27~45 天第五鳃弓表达量显著大于第四鳃弓（P<0.05），在第54 天第四、第五鳃弓表达量相近（图5E）。spp1基因在第9 天和第18 天第四、第五鳃弓表达量相差不大，在第27~54 天第五鳃弓表达量显著高于第四鳃弓（P<0.05），其中36 和45 d 的表达量差异更为明显（图5F）。

图5 团头鲂SCPP家族基因在早期咽齿发育阶段的相对表达量Fig.5 Relative expression of SCPP family genes in the early pharyngeal tooth developmental stages in M.amblycephala

3 讨 论

本研究中系统进化分析表明，enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1在鲤科鱼类与人、鼠和鸡等高等脊椎动物类都各自聚为一支，青鳉与秀美花鳉enam、scpp9、odam和spp1基因聚为一支，这表明这2个物种不仅亲缘关系较为接近，且与咽齿发育的形成潜在相关。在enam基因的进化树中斑点雀鳝与人、鼠、鸡等高等脊椎动物聚为一支，推测鱼类的enam在基因复制过程中发生了功能的分化[14］，鱼类enam与高等脊椎动物同源性更高，但在不同物种中的同源性变异性较大，在同一科中存在高度保守性。

已有研究表明分泌型钙结合磷蛋白（SCPP）基因家族对咽齿的形成至关重要[15-16］，富含（P/Q）的SCPP 家族基因的假基因化可能导致许多脊椎动物如鸟类、海龟和一些哺乳动物失去其牙颌[17］。以前的研究假设，大多数富含（P/Q）的SCPP 基因的丢失可能是导致合颌动物咽齿缺失的原因[18-19］。在慈鲷科鱼类中，与小齿鱼类相比，scpp5在大齿鱼类的下咽颌中有着更高的表达[20］，这表明富含（P/Q）的SCPP基因可能在咽部咽齿的形成中发挥调控作用。

enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在1 龄团头鲂不同组织中的表达分析结果显示，enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在1 龄团头鲂的第五鳃弓表达量显著高于第四鳃弓（P<0.05），且在肋骨中也有较高的表达，这与Kawasaki 等[1］所报道的酸性SCPP蛋白参与骨和牙本质矿化、而富含脯氨酸和谷氨酰胺的SCPP 蛋白则参与釉质和类珐琅质矿化的过程相一致。已有研究表明硬骨鱼都有连续咽齿替换的现象，在口腔或咽腔的咽齿过了功能期后，一颗咽齿被同一位置（位点）的新咽齿替换，这种咽齿的更替持续终生，如斑马鱼和青鳉[21-22］。enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因在9~54 d团头鲂第四、第五鳃弓中的定量表达结果恰恰证实了这一观点。enam、ambn和scpp9基因在9~54 d 第四鳃弓始终处于一个较低的表达量，而第五鳃弓中的表达量呈现上升趋势，推测enam、ambn和scpp9在团头鲂早期咽齿生长发育过程中起关键调控作用。scpp1在9~54 d 团头鲂第四鳃弓中的表达量与第五鳃弓表达量无明显差异，9~27 d 第五鳃弓中表达量大于第四鳃弓，36~54 d第四鳃弓中的表达量略高于第五鳃弓，综合1 龄团头鲂的定量表达结果，推测scpp1基因在团头鲂早期咽齿发育过程中并无明显调控作用，其发挥调控作用的时间可能在2月龄后。在本研究中团头鲂odam和spp1基因调控蛋白在第36和45 天出现峰值，可能是团头鲂早期咽齿发育循环周期结束的时期。

本研究通过对咽齿发育相关的enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因的CDS 区克隆和同源性分析，推测鱼类SCPP 基因与鱼类咽齿发育相关。结合团头鲂9~54 d 第四、第五鳃弓和1 龄团头鲂不同组织的基因表达分析，明确了enam、scpp1、ambn、scpp9、odam和spp1基因的表达与鱼类咽齿发育具有一定的相关性。