甲咪唑烟酸对水稻田土壤微生物数量及土壤酶活性的影响

孙丽丽，黎婉玲，张 纯，顾文杰,3，李雅莹，卢钰升，姜礼尧，王 丹

（1.广东省农业科学院农业资源与环境研究所/农业农村部南方植物营养与肥料重点实验室/广东省养分资源循环利用与耕地保育重点实验室/广东省土壤微生物与耕地保育工程技术研究中心，广东 广州 510640；2.广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，广东 茂名 525000）

【研究意义】水稻是我国南方广泛种植的重要农作物，播种面积占64%以上，在国内粮食供给方面具有重要战略地位［1］。然而，南方高温高湿气候条件导致水稻田杂草频发，且品种多样难以根除，严重制约了水稻的优质、高效生产［2］。目前，水稻田主要的除草方式为化学除草、人工除草和生物除草。生物除草剂是指直接利用有效防治特定杂草的完整生物体或者是部分活体组织生产出来的活生物产品，但因其防治谱窄、价格高，在田间未广泛推广［3］。人工除草成本高、除草效率低。而化学除草剂施用简单、效果持久、成本低廉，且在农业生产中带来较好的经济效益［4-5］，使其在短时间内不可替代。但是化学除草剂施用后会残留在土壤中，其广泛应用所引发的水体污染、土壤污染及药害问题日趋严峻［4,6-7］。

【前人研究进展】化学除草剂的环境残留一方面可通过食物链富集效应对人畜健康造成直接或潜在危害，另一方面可带来更为严峻的继发风险——对土壤微生态的干扰。土壤微生物和土壤酶活性作为土壤活性及养分，是反映农田土壤肥力与各种生理生化反应过程的关键指标。其中，土壤微生物总数及多样性可初步判断土壤肥力的高低及土壤营养状况［8-9］；细菌是元素生物地球化学循环的主要驱动因素，真菌可促进植物生长和养分循环，在维持生态系统的可持续发展中发挥关键作用，因此，土壤微生物的数量与种类可作为土壤健康的生物学指标［10-11］。目前，许多研究已发现化学除草剂对土壤微生物的数量、比例和群落结构均存在不同程度的影响。周小会等研究发现二氯喹啉酸残留对烟草根际土壤微生物数量有明显的影响［12］；在不同种类化学除草剂酰胺类、二苯醚类、四唑啉酮类等影响下，水稻田土壤微生物丰度、比例和多样性均发生特异性改变［2,6,13］。以上结果暗示着不同类型微生物在不同除草剂下的适应性存在差异，而该差异在土壤酶活性的响应可显著改变土壤代谢过程与土壤肥力；但是，目前对于不同耕作模式下水稻田土壤耐受菌在施用除草剂后土壤酶活性响应的比较分析尚鲜见报道。

【本研究切入点】咪唑啉酮类除草剂是水稻田施用最为高效的化学除草剂之一，由于其高效、低毒特性，而应用广泛［6,14］。甲咪唑烟酸是咪唑啉酮类除草剂系列中最常用的一种［15］，主要用于防除1 年生单、双子叶杂草及部分多年生杂草，对莎草科杂草、稷属杂草、草决明、播娘蒿等具有很好的活性。然而，关于甲咪唑烟酸对南方稻田土壤微生态的影响少有报道。【拟解决的关键问题】本研究对可培养的除草剂耐受微生物数量进行监测，并对不同除草方式、不同种植模式的稻田土壤酶活性进行测定和对比，旨在为施用除草剂对农田土壤生态的影响提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试土壤

研究区域选取广东省广州市白云区钟落潭镇广东省农业科学院白云基地水稻种植土壤（23°23′30″N，113°25′13″E），水稻种植于2020年8－12 月。采集0～20 cm 耕层土壤，采用五点取样法取样，低温运送回实验室。样品混合均匀后分为两部分，一部分风干后过孔径0.2 mm 筛于室温保存，另一部分鲜土用于测定可培养微生物数量。

1.2 试验方法

1.2.1 不同除草剂对水稻田土壤微生物影响的室内试验 选用二甲戊灵、氰氟草脂、苄嘧磺隆、二氯喹啉酸、草甘膦、吡氧苄啶、异噁草松、甲咪唑烟酸、丙草胺、草铵膦等10 种常用除草剂，对试验区域水稻田土壤中除草剂耐受菌数量进行检测。取10 g 水稻田土壤，溶于90 mL 无菌水，振荡培养30 min，然后采用梯度稀释法涂布于基本培养基，培养基配方为每1 000 mL 去离子水中包含：七水硫酸镁 0.2 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸二氢钾1 g，氯化钠1 g，氯化钙0.02 g，六水氯化铁0.05 g，硝酸铵1 g，葡萄糖5 g，酵母膏0.5 g，115 ℃高温高压灭菌15 min。分别对土壤中细菌、真菌、放线菌进行平板计数。除草剂耐受菌培养基为上述基本培养基，分别添加200 mg/L 不同除草剂（过滤除菌），根据菌落形态特征进行可培养细菌、放线菌、真菌计数。

1.2.2 甲咪唑烟酸对不同播种方式水稻田土壤微生物影响的大田试验 选取1.2.1 中水稻田土壤除草剂耐受微生物数量最高的甲咪唑烟酸进行大田试验，分别对水稻田两种播种方式水直播与旱直播设置人工除草和添加甲咪唑烟酸处理正交实验，试验设水直播+甲咪唑烟酸、水直播+人工除草、旱直播+甲咪唑烟酸、旱直播+人工除草4 个处理，每个处理4 次重复。各田块种植过程农艺操作一致，除草剂处理于水稻苗后、杂草芽后1～3 叶期按照每20 m2分别用240 g/L 甲咪唑烟酸水剂0.75 mL，兑水1.5 L 茎叶喷施。水稻收获后采集土壤，并对土壤耐受微生物、土壤理化性质和酶活性进行测定。

1.3 水稻田土壤微生物计数

称取10 g 新鲜土壤，转移到装有90 mL 无菌水三角瓶中，加入无菌玻璃珠，放入振荡器中室温条件下振荡20 min，稀释浓度梯度为10-5、10-4、10-3、10-2，然后吸取不同稀释度的菌悬液各0.1 mL 接种至培养基中，用三角涂布棒涂抹均匀。按照常规平板涂布法培养微生物计数，采用稀释平板计数法测定土壤中的微生物。

微生物数量以每克干土中的菌落数（CFU/g，干土）表示，计算公式为：每克干土中所含微生物数量（CFU/g，干土）=计数皿平均菌落数×计数皿稀释倍数/0.1×水分系数。

1.4 土壤理化性质及酶活性分析

土壤pH 采用酸度计电位法测定土壤悬浊液（土液比为1 ∶2.5），土壤有机质采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定，土壤碱解氮采用氢氧化钠扩散法测定，土壤速效磷采用钼锑抗比色法测定，土壤速效钾含量采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定，含水率用烘干法测定，土壤脲酶活性采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，过氧化物酶活性采用邻苯三酚-乙醚提取法测定，土壤过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定。

1.5 数据分析

试验数据使用Origin 2017 作图，使用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan法。相关性分析采用凌波微课组内相关性在线软件进行分析（http://www.cloud.biomicroclass.com/CloudPlatform/home）。

2 结果与分析

2.1 水稻种植前土壤耐受不同除草剂的可培养微生物数量比较

平板菌落计数结果（表1）显示，水稻种植前基础土的土壤中可培养细菌总量最多，可培养放线菌总量次之，可培养真菌总量最少。除草剂耐受菌计数结果显示微生物对于不同除草剂耐受响应存在显著差异，基础土中耐受二甲戊灵、吡氧苄啶、氰氟草脂、苄嘧磺隆、草甘膦、丙草胺及草铵膦的细菌和放线菌数量较总数显著下降，其中氰氟草酯、吡氧苄啶、丙草胺、草铵膦及二甲戊灵可培养耐受细菌数量最少，仅占可培养细菌总量的1.3%～6.8%；二氯喹啉酸、苄嘧磺隆及草甘膦可培养耐受细菌数量次之，约为可培养细菌总量的11.5%～23%；而异噁草松和甲咪唑烟酸可培养耐受细菌数量最高，分别达可培养细菌总量的82.4%和90.5%。耐受二氯喹啉酸的可培养真菌数量最少，占可培养真菌总量的18.5%；耐受氰氟草脂、苄嘧磺隆、吡氧苄啶、草铵膦的可培养真菌数量次之，占可培养真菌总量的35%～51.6%；耐受二甲戊灵、甲咪唑烟酸的可培养真菌数量最高，分别占可培养真菌总量的76.9%和70.6%。氰氟草脂、二甲戊灵、草铵膦、草甘膦及苄嘧磺隆对可培养耐受放线菌数量的影响最大，检测量仅为可培养放线菌总量的1.3%～19.7%，吡氧苄啶、异噁草松、甲咪唑烟酸、丙草胺对可培养放线菌的影响相对较大，约为可培养放线菌总量的35.5%～51.1%，二氯喹啉酸对可培养放线菌的影响最小，约为可培养放线菌总量的76.3%。

表1 水稻种植前土壤耐受不同除草剂的可培养微生物总量Table 1 Number of culturable herbicide-resistant microorganisms in pre-planting paddy soil

综上可知，与其他8 种除草剂相比，甲咪唑烟酸及异噁草松对土壤微生物生长的影响相对较小。有研究显示异噁草松在推荐剂量下不仅会引起小麦轻微萎黄病病害，严重影响小麦产量［16］，而且还会引起水稻苗白化现象［17-18］。因此，本研究选择甲咪唑烟酸在水稻田进行监测试验。

2.2 稻田施用甲咪唑烟酸对不同种植模式土壤理化性质及酶活的影响

2.2.1 稻田施用甲咪唑烟酸对不同种植模式土壤理化性质的影响 试验结果（表2）显示，与人工除草处理相 比，水直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤水解性氮、速效钾、有机质分别提升15.6%、6.6%、19.2%，土壤pH 显著下降；旱直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤水解性氮、速效钾、有机质分别提升18.9%、35%、4.5%，有效磷下降11.1%，土壤pH 上升。与水直播模式相比，旱直播模式人工除草处理土壤水解性氮、速效钾、有机质分别提升15.9%、4.0%、33%，但有酸化趋势；旱直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤水解性氮、速效钾、有机质分别提升19.3%、31.8%、16.6%，有效磷下降9.0%。

表2 不同除草方式、不同种植模式土壤理化性质Table 2 Soil physicochemical properties under different weeding methods and planting modes

2.2.2 稻田施用甲咪唑烟酸对不同种植模式土壤酶活性的影响 试验结果（表3）显示，与人工除草处理相比，水直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤过氧化物酶活性显著提升30%，而过氧化氢酶、酸性磷酸酶、脲酶活性有所下降，差异不显著；与人工除草处理相比，旱直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤脲酶活性显著提升136.2%，酸性磷酸酶活性显著提升9.6%，过氧化氢酶活性上升，过氧化物酶活性下降。与水直播模式除草剂处理相比，旱直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤过氧化氢酶、脲酶活性分别显著提升43.2%和175.8%；过氧化物酶活性有所提升，差异不明显。

表3 不同除草方式、不同种植模式的土壤酶活性Table 3 Soil enzyme activities under different weeding methods and planting modes

2.3 稻田施用甲咪唑烟酸对不同种植模式土壤微生物的影响

采用平板菌落计数法监测不同除草方式对水直播及旱直播水稻土壤可培养微生物数量影响。如表4 所示，与种植前土壤相比，种植后土壤耐受甲咪唑烟酸细菌总数、真菌总数显著升高，可培养放线菌总数升高但差异不显著。细菌实验结果分析：与人工除草处理相比，水直播模式甲咪唑烟酸处理土壤细菌总数及除草剂耐受细菌数量分别下降28.7%、29.5%（P＜0.05），旱直播模式不同除草处理间土壤细菌总数及除草剂耐受细菌数量差异不显著。与水直播模式相比，旱直播模式甲咪唑烟酸处理土壤细菌总数及除草剂耐受细菌数量分别上升28%、34.3%（P＜0.05）。旱直播与水直播模式人工除草处理间土壤细菌总数及除草剂耐受细菌数量没有显著差异。表明水直播模式施用除草剂甲咪唑烟酸会抑制土壤细菌的生长。可培养放线菌平板计数结果显示，耐受甲咪唑烟酸放线菌数量较可培养放线菌总量均显著降低。水直播模式甲咪唑烟酸处理较人工除草处理土壤放线菌总量下降24.2%，旱直播模式甲咪唑烟酸处理较人工除草处理下降26.7%，除草剂耐受放线菌数量分别下降40.7%、45.9%（P＜0.05）。同种除草方式下，旱直播较水直播模式土壤放线菌总量均上升（P＜0.05）。总体来看，施用除草剂甲咪唑烟酸会抑制土壤放线菌的生长。可培养真菌平板计数实验结果显示，与种植前土壤相比，种植后土壤耐受甲咪唑烟酸真菌总数显著升高，旱直播模式土壤可培养真菌数量显著提升。水直播模式甲咪唑烟酸处理较人工除草处理土壤真菌总数下降7.1%，旱直播模式甲咪唑烟酸处理较人工除草处理土壤真菌总数下降21.5%，差异均不显著。相同除草方式下，旱直播模式较水直播模式土壤真菌总数及除草剂耐受真菌数量均提升，耐受甲咪唑烟酸真菌数量较可培养真菌总量无显著差异。

表4 不同除草方式、不同种植模式土壤微生物数量Table 4 Number of culturable microorganisms in soil under different weeding methods and planting modes

2.4 稻田施用甲咪唑烟酸对水稻产量的影响

种植一季水稻后，测定稻谷产量，水直播模式施用甲咪唑烟酸处理水稻产量为503 kg/667m2，人工除草处理水稻产量为386 kg/667m2；旱直播模式甲咪唑烟酸处理水稻产量为533 kg/667m2，人工除草处理水稻产量为288 kg/667m2。在同种直播模式下，施用甲咪唑烟酸处理较人工除草处理的水稻产量均显著提升，水直播与旱直播模式甲咪唑烟酸处理产量之间的差异不显著。

2.5 土壤理化性质-土壤酶活性-微生物数量相关性分析

土壤理化性质是影响土壤微生态的主要驱动力之一，通过分析不同处理间土壤酶活性、土壤微生物数量与土壤理化性质的相关性，可以初步揭示除草剂对土壤微生物影响的可能机制。如图1 所示，土壤过氧化氢酶活性与速效磷呈极显著负相关，脲酶活性与速效磷呈显著负相关、与速效钾呈显著正相关，酸性磷酸酶与脲酶活性呈极显著正相关。由此可知，本研究中土壤速效磷、速效钾是影响土壤酶活性的重要环境因子。土壤微生物数量与所列的土壤理化性质没有显著相关性，暗示着本研究中稻田土壤的速效氮、磷、钾等营养元素可能不是限制微生物数量的主要环境因子。

图1 土壤理化性质-土壤酶活-可培养微生物数量相关性分析Fig.1 Correlation analysis of soil physicochemical property,soil enzyme activity and number of culturable microorganisms

3 讨论

本研究首先采用平板计数法测定水稻种植前基础土壤不同除草剂可培养耐受菌数量，实验结果表明，二甲戊灵、吡氧苄啶、氰氟草脂、苄嘧磺隆及草铵膦毒性可能对土壤中细菌和放线菌群落影响较大，二氯喹啉酸毒性对土壤中真菌群落影响较大，10 种化学除草剂均选取常用不同种类代表，在实验室耐受实验中，均选取200 mg/L 固定浓度进行耐受实验，尽管不是其最适施用浓度，但可为相同浓度下不同种类除草剂耐受微生物数量比较提供依据。

与人工除草处理相比，水直播模式甲咪唑烟酸处理土壤过氧化物酶升高，暗示着水直播模式土壤过氧化物酶活性更易受甲咪唑烟酸的影响。相关性分析结果显示，脲酶活性与速效磷呈负相关，与速效钾呈正相关。而旱直播模式甲咪唑烟酸除草处理脲酶活性显著升高，这可能与旱直播除草剂处理土壤的速效磷与速效钾浓度有关。前人研究表明，除草剂对土壤酶活性的影响多表现低浓度抑制，高浓度激活［19-21］，暗示了除草剂通过影响土壤-微生物-植物互作方式改变土壤理化性质，从而影响土壤酶活性，甲咪唑烟酸对以上酶活性是否产生直接影响尚需进一步验证。

与种植前相比，种植一茬水稻后土壤中可培养微生物及耐受甲咪唑烟酸的可培养微生物数量均呈增加趋势，表明作物与土壤微生物的根际互作可促进根际土壤中可培养及耐受除草剂微生物的生长，暗示着根际互作过程可以富集微生物、提升土壤活力，这与申建波等的研究结果一致［19］。水直播模式施用甲咪唑烟酸处理可培养细菌及除草剂耐受细菌数量减少。无论是水直播还是旱直播模式，施用甲咪唑烟酸都会抑制土壤放线菌的生长，暗示大田施用除草剂会抑制土壤微生物的生长，与前人的研究结果一致［20-21］。本研究中，施用甲咪唑烟酸处理前后，土壤中细菌、真菌、放线菌都未产生明显的除草剂抗性，表明短期施用推荐剂量甲咪唑烟酸不会对土壤微生物的除草剂抗性造成影响，然而长期施用对土壤微生物和水稻产量的影响有待继续监测。

本研究中施用甲咪唑烟酸处理的水稻产量显著高于人工除草，表明短期且小剂量除草剂可以为农业生产带来较好的经济效益［4-5］。土壤微生态的破坏是除草剂诱发的重要环境风险［22-24］，本研究中一次性施用甲咪唑烟酸对土壤细菌和放线菌均产生不同程度的抑制作用，暗示着长期大量施用化学除草剂仍可能为土壤微生态带来风险。除草剂的发展方向是高效、低毒、残留期短［25-27］，甲咪唑烟酸长期施用在土壤中的残留及对水稻田土壤微生态的影响仍有待进一步研究。

4 结论

在种植一茬水稻后，水直播模式甲咪唑烟酸除草处理土壤过氧化物酶活性提升30%（P＜0.05），旱直播模式甲咪唑烟酸除草处理脲酶活性提升136.2%（P＜0.05），酸性磷酸酶活性提升9.6%（P＜0.05）。相关性分析结果显示，土壤速效磷、速效钾是影响土壤酶活性的重要环境因子。与人工除草处理相比，水直播模式甲咪唑烟酸处理细菌总数及除草剂耐受细菌数量分别下降28.7%、29.5%（P＜0.05），旱直播模式不同除草处理间细菌总数及除草剂耐受细菌数量差异不显著。水直播模式甲咪唑烟酸处理较人工除草处理放线菌总数下降24.2%，旱直播模式甲咪唑烟酸处理较人工除草处理下降26.7%，除草剂耐受放线菌数量分别下降40.7%、45.9%（P＜0.05）。与人工除草处理相比，施用除草剂对稻田土壤真菌数量的影响不显著。综上可知，水直播模式施用甲咪唑烟酸能够有效提升稻田土壤过氧化物酶活性，旱直播模式能够有效提升土壤酸性磷酸酶和脲酶活性。水直播模式施用除草剂甲咪唑烟酸会抑制土壤细菌的生长；无论是水直播还是旱直播模式，施用甲咪唑烟酸都会抑制土壤放线菌的生长。