外源Ca2+对模拟酸雨胁迫下不同抗性水稻根系氮吸收的影响

张元棋，梁婵娟,2*

（1.江苏省厌氧生物技术重点实验室，江南大学环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122；2.江苏水处理技术与材料协同创新中心，苏州科技大学，江苏 苏州 215009）

尽管近年来全球酸雨态势有所减缓，但我国仍有4.66×107hm2的国土面积为酸雨区[1]。酸雨会抑制植物根系生长[2]，破坏其吸收养分的能力[3]；引起活性氧过量积累，造成氧化损伤[4-5]；破坏叶绿体微观结构，减少叶绿素含量，降低光合作用能力[6-7]。酸雨还会通过淋溶土壤中的，使土壤贫瘠[8]、农作物生长缓慢，引起农业减产，提高作物耐受性可能是缓解酸雨区农业减产的一种可行方法。

已有研究发现外源Ca2+能提高植物对盐、干旱及低温等非生物胁迫的耐受能力[9-12]。酸雨胁迫下，外源Ca2+能通过提高抗氧化酶活性、同工酶浓度及基因表达缓解酸雨造成的氧化胁迫[4-5]，通过调节细胞质膜组分及胞内Ca2+形态促进质膜稳定性[13]，提高植物对酸雨的耐受性。同时有研究发现外源Ca2+缓解酸雨胁迫下大豆品质与调控其营养吸收有关[14]。然而外源Ca2+和酸雨胁迫下植物营养吸收与植物耐酸性的关系仍不明确，明确这一点将有助于提高植物耐酸性，从而为缓解酸雨对作物产量及品质的影响提供良好的生长基础。氮是限制植物生长最重要的因素之一[15]。水稻主要以NO-3和的形式吸收无机氮，这一过程需要H+-ATPase 水解ATP提供能量，同时向胞外泵出H+维持胞内pH 稳定，保障氮吸收的稳定和平衡是维持水稻生长和发育的基础。明晰外源Ca2+如何通过H+-ATPase 调节酸雨胁迫下植物氮吸收，将为丰富植物耐酸性机制提供新的理论支撑，同时也为缓解酸雨造成的土壤肥力下降提供思考方向。

为了提高植物耐酸性，同时进一步探明外源Ca2+调控机理和调控效果的品种间差异，本研究选取了两个广泛种植的水稻品种——五优308（抗性种）和南粳9108（敏感种）。首先，探究外源Ca2+对酸雨胁迫与恢复后水稻根系生长与氮（NO-3和）含量的影响，明晰外源Ca2+调控酸雨胁迫下植物氮吸收与耐受性的关系；其次，测定根系 NO-3、吸收速率，ATP 含量和质膜H+-ATPase 活性，探究外源Ca2+调控酸雨胁迫下植物根系质膜H+-ATPase 活性对氮吸收的影响；最后，从质膜H+-ATPase 磷酸化水平角度探析外源Ca2+调控酸雨胁迫下植物根系质膜H+-ATPase 活性的内在机制。通过对比外源Ca2+与酸雨处理下两个水稻品种生长、氮吸收及质膜 H+-ATPase 活性与磷酸化的差异，客观评价外源Ca2+调控植物耐酸性的效果，为采取有效措施减轻酸雨对农业生产的影响提供理论依据，为缓解酸雨引起的粮食安全问题提供新的选择。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验试材为水稻（Oryza sativaL.），品种为五优308（抗性种）和南粳9108（敏感种）。品种筛选是根据郭莉莉等[16]的研究结果，考虑长江中下游地区种植的常见水稻品种，并在模拟酸雨（pH 4.5 或3.0）下通过相对生长速率、根系质膜透性以及叶片叶绿素含量指标筛选比较得出的抗性差异。将种子浸泡于0.1%的HgCl2中10 min后取出，使用去离子水冲洗干净后，置于去离子水中浸泡24 h。种子转移至蛭石中，于25 ℃恒温萌发，长至两叶时转移至24 孔泡沫板并置于6.88 L 周转箱培养，培养条件参考马永佳等[13]的方法。营养液配制按照国际水稻研究所常规水稻营养液配方，营养液每3 d更换一次。

1.2 试验方法

1.3 指标测定方法

试验材料使用去离子水冲洗，105 ℃烘30 min 后80 ℃烘至质量恒定，测定根系干质量。采用水杨酸-硫酸法和靛酚蓝比色法分别测定根（以鲜质量计）中NO-3和含量[18-19]。

采用GAO 等[20]的方法测定并计算NO-3和的吸收速率，计算公式分别为：

NO-3吸收速率=（初始营养液中NO-3浓度-处理5 d后营养液中NO-3浓度）×营养液体积（/根鲜质量×5）

质膜H+-ATPase 活性使用质膜蛋白提取试剂盒（贝博生物科技有限公司，上海）提取测定。参考LIANG 等[21]的方法使用定磷试剂测定反应体系中生成的无机磷含量，并根据以下公式进行计算:

式中：E为酶活，µmol·mg-1·min-1；C为标准曲线上查得的无机磷含量，µg·mL-1；t为反应时间，min；Wp为膜制剂中的蛋白含量，mg·mL-1；n为稀释倍数。

H+-ATPase 磷酸化水平使用Western-Blot 方法测定，使用8%浓缩胶和6%分离胶在120 V、30 min 和80 V、55 min 条件下电泳以分离目标蛋白。使用半干法转膜后用5%BSA溶液封闭PVDF膜2 h，以1∶2 000比例4 ℃静置过夜孵育一抗（14-3-3 蛋白），用PBST溶液清洗3 次，再以1∶1 000 比例加入二抗（HRP-驴抗兔 IgG 抗体）室温孵育 2 h，最后用 PBST 清洗 3 次，显影后进行拍摄。

根系ATP 含量（以鲜质量计）测定参考文献[22]，使用高效液相色谱法测定。具体条件为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），柱温25 ℃，流速1.2 mL·min-1，UV 254 nm，进样量 20 µL，流动相 A 为 0.06 mol·L-1Na2HPO4、0.04 mol·L-1KH2PO4，pH 7.0，流动相B 为纯乙腈。洗脱程序：0 min 100% A；2 min 95% A 和5%B；4 min 80% A 和 20% B；5.3 min 75% A 和 25% B；6 min 100%A。

1.4 数据处理

采用SPSS 18.0 对数据进行显著性分析，不同字母表示处理间差异显著（P<0.05）。数据分析后使用Origin 2021 绘图，绘图数据均为3 次独立试验数据的平均值±标准误差（Mean±SD）。

2 结果与分析

2.1 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻幼苗根系生长和根中NO-3、含量的影响

如图 1 所示，胁迫期，与 CK 相比，SAR1 处理下，五优308 幼苗根系干质量以及NO-3和含量无显著变化（P>0.05）；南粳9108 幼苗根系干质量显著降低（P<0.05），NO-3含量无显著变化（P>0.05），含量显著增加（P<0.05）。SAR2 处理下，两个品种水稻根系干质量、NO-3和含量均低于CK（P<0.05），五优308的降幅分别为15%、24%、19%，南粳9108的降幅分别为31%、42%、20%。单一外源Ca2+处理对两个品种水稻根系生长以及根中NO（-3除五优308）和含量均无显著影响（P>0.05）。Ca2++SAR1 处理下，两个品种水稻幼苗根系干质量、根中NO-3和含量与 CK 均无显著差异（P>0.05），但两个品种水稻的根干质量均显著高于 SAR1 处理（P<0.05）。Ca2++SAR2 处理下，两个品种水稻幼苗根干质量、根中NO-3和含量均低于CK（P<0.05），但显著高于SAR2 处理（P<0.05），五优308 上述3 个指标分别达到CK 的93%、88%、92%，南粳9108 分别达到CK 的77%、80%、88%。恢复期，五优308 各处理组中根系生长、NO-（3除Ca2++SAR2 处理）和含量均恢复至CK 水平（P>0.05）。在南粳 9108 中，SAR2 处理和 Ca2++SAR2 处理下根系生长和含量仍低于CK（P<0.05），但Ca2++SAR2 处理高于SAR2 处理（P<0.05）。SAR2 处理下南粳9108根中NO-3含量低于CK（P<0.05），但在Ca2++SAR2 处理下恢复至CK水平（P>0.05）。

图1 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根干质量和根中NO-3、含量的影响Figure 1 Effects of exogenous Ca2+on root dry mass,NO-3 and contents of roots in different resistant rices to simulated acid rain stress

2.2 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系NO-3和吸收速率的影响

如图 2 所示，胁迫期，SAR1 处理下，五优 308 的NO-3和吸收速率高于 CK（P<0.05），南粳 9108 的NO-3吸收速率无显著变化（P>0.05），吸收速率高于CK（P<0.05）。SAR2 处理下，两个品种水稻根系NO-3和吸收速率均低于 CK（P<0.05），五优 308 降幅分别为42%、27%，南粳9108 降幅分别为45%、33%。单一外源Ca2+处理下五优308 的NO-3吸收速率高于 CK（P<0.05），吸收速率无显著变化（P>0.05）；南粳9108的NO-3和吸收速率均无显著变化（P>0.05）。Ca2++SAR1处理下，两个品种水稻根中NO-3和吸收速率与CK 无显著差异（P>0.05），NO-3吸收速率与SAR1 处理无差异（P>0.05），吸收速率低于 SAR1 处理（P<0.05）。Ca2++SAR2 处理下，两个品种水稻的NO-3和吸收速率均低于CK 水平（P<0.05），但高于SAR2处理（P<0.05），五优308中分别为CK 的 83%、87%，南粳 9108 中分别为 CK 的 82%、80%。恢复期，五优308除在SAR2处理下NO-3吸收速率仍低于CK 外（P<0.05），其余处理均恢复至CK 水平（P>0.05），吸收速率在所有处理下均恢复至CK水平（P>0.05）。南粳9108在SAR2处理下NO-3和吸收速率仍低于CK 水平（P<0.05），Ca2++SAR2 处理下NO-3吸收速率低于CK但高于SAR2处理（P<0.05），其他处理下NO-3和吸收速率均恢复至CK水平（P>0.05）。

图2 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系NO-3和吸收速率的影响Figure 2 Effects of exogenous Ca2+on NO-3 and uptake rates of different resistant rices root under simulated acid rain stress

2.3 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系质膜H+-ATPase活性和根中ATP含量的影响

如图3 所示，胁迫期，SAR1 处理下两个品种水稻根系质膜 H+-ATPase 活性高于 CK（P<0.05），ATP 含量均降低（P<0.05），五优 308 和南粳 9108 中 H+-ATPase 活性增幅分别为16%、20%，ATP 含量降幅分别为25%、31%。SAR2 处理下，两个品种水稻H+-ATPase 活性以及 ATP 含量均低于 CK（P<0.05），五优308 降幅分别为32%、31%，南粳9108 降幅分别为43%、50%。单一外源Ca2+处理下两个品种水稻根系H+-ATPase 活性与 CK 无差异（P>0.05），根中 ATP 含量低于CK（P<0.05）。Ca2++SAR1处理下，两个品种水稻H+-ATPase活性与CK无显著差异（P>0.05），其中在五优308中与SAR1处理无差异（P>0.05），在南粳9108中低于SAR1处理（P<0.05）；两个品种水稻根中ATP含量均显著低于CK（P<0.05），在五优308中高于SAR1处理（P<0.05）。Ca2++SAR2 处理下，两个品种水稻H+-ATPase活性和ATP含量均低于CK水平（P<0.05），五优308中分别达CK水平的82%、78%，南粳9108中分别达到 CK 水平的 80%、69%，但均高于 SAR2 处理（P<0.05）。恢复期，五优 308 H+-ATPase 活性和ATP 含量在所有处理下均恢复至CK水平（P>0.05）。南粳9108在SAR2处理下H+-ATPase活性和ATP含量仍低于CK水平（P<0.05），Ca2++SAR2处理下ATP含量仍低于CK但高于SAR2处理（P<0.05），H+-ATPase活性恢复至CK水平（P>0.05）。南粳9108在其他处理下H+-ATPase活性和ATP含量均恢复至CK水平（P>0.05）。

图3 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系质膜H+-ATPase活性和ATP含量的影响Figure 3 Effects of exogenous Ca2+on H+-ATPase activities and ATP contents of different resistant rices root under simulated acid rain stress

2.4 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系质膜H+-ATPase磷酸化水平的影响

如图4所示，胁迫期，SAR1处理下，五优308根系质膜 H+-ATPase 磷酸化水平高于CK（P<0.05），南粳9108 H+-ATPase 磷酸化水平与CK 无差异（P>0.05）；SAR2处理下，五优308根系质膜H+-ATPase磷酸化水平与CK无差异（P>0.05），在南粳9108中显著低于CK（P<0.05）。单一外源 Ca2+处理下，五优 308 的H+-ATPase磷酸化水平与CK无差异（P>0.05），在南粳9108中则显著增加（P<0.05）。Ca2++SAR1处理下，五优308的H+-ATPase 磷酸化水平与CK 无差异，但低于SAR1处理（P<0.05），南粳9108 H+-ATPase磷酸化水平与CK和SAR1处理均无差异（P>0.05）。Ca2++SAR2处理下，五优308中H+-ATPase磷酸化水平与CK和SAR2处理均无显著差异（P>0.05），南粳9108中H+-ATPase磷酸化水平与CK 无差异（P>0.05），但高于SAR2 处理（P<0.05）。恢复期，五优308的H+-ATPase 磷酸化水平在所有处理下均恢复至CK水平（P>0.05），而南粳9108的H+-ATPase 磷酸化水平在SAR2处理下仍低于CK（P<0.05），但其余处理均恢复至CK水平（P>0.05）。

图4 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系质膜H+-ATPase磷酸化水平的影响Figure 4 Effects of exogenous Ca2+on phosphorylation levels of H+-ATPase in roots plasma membranes of rice under simulated acid rain stress

3 讨论

3.1 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻幼苗生长和氮吸收及供能的影响

根系是植物从环境中获取养分的重要器官，其对植株整体的生长状况有重要影响。NO-3和是植物必需的无机氮，NO-3的吸收需要H+-ATPase 水解ATP提供质子驱动力，的吸收伴随着胞内pH 增加，也需要H+-ATPase 泵出多余的H+以维持细胞pH 稳定[23]，然而过量积累会引起铵毒效应[24-25]。本研究发现SAR1 处理均刺激了两个品种水稻根系H+-ATPase 活性，促进了ATP 水解，增加了供能，促进了两个品种水稻的吸收和五优308 的NO-3吸收。该处理下五优308 中NO-3和含量没有显著变化，根系生长没有受到影响，南粳9108 中含量显著增加，根系生长受到抑制。在南粳9108幼苗根系中积累，需要向胞外排出H+以维持胞内pH 稳定，导致根系环境pH 降低[26]，从而加剧了对根系生长的抑制。此外，的增加破坏了水稻根系环境中阴阳离子平衡[23]，这也不利于南粳9108 根系生长。SAR1 处理尽管增加了NO-3的吸收，但并未引起根中NO-3含量的显著增加，这可能是NO-3向上转运，分配到叶中的量增加所致。本研究还发现SAR2 处理抑制了两个品种水稻根系质膜H+-ATPase 活性，减少了ATP 含量，供能减少导致NO-3和吸收和积累减少，根系生长受到抑制，其中对南粳9108 的抑制程度更大。与本研究结果一致，有研究发现在盐胁迫下，低强度盐胁迫会刺激H+-ATPase 活性增加，促进营养元素的吸收，而高强度盐胁迫则抑制H+-ATPase 活性，减少对氮的吸收，从而使植物生物量减少[22]。因此推测低强度（pH 4.5）酸雨胁迫下水稻根系质膜H+-ATPase 活性的增加可能是一种适应性反应，以此提高植物对胁迫的耐受能力，高强度（pH 3.0）酸雨则超出了水稻的耐受范围，引起H+-ATPase 活性的下降。此外，铝胁迫下，耐受性品种玉米中氮素吸收受抑制程度小于敏感性玉米[27]，这与本研究结果发现的酸雨胁迫下品种变化的差异类似。

研究表明外源Ca2+能缓解重金属、低氧以及盐胁迫对植物NO-3吸收的抑制，从而缓解对植物生长的抑制[20，28-29]。本研究结果显示，Ca2++SAR1 处理可使两个品种水稻根系质膜H+-ATPase 活性稳定在CK 水平，有利于分解ATP，稳定NO-3和吸收，从而缓解了根系生长受到的抑制。这与我们先前的研究结果一致，低浓度（pH 4.5）酸雨下，外源Ca2+降低大豆H+-ATPase 活性至对照水平，调节其营养吸收平衡，有效缓解了酸雨对生长的抑制[14]。本研究结果还显示，Ca2++SAR2处理对两个品种水稻根中H+-ATPase活性降低和ATP 含量减少有缓解作用，但缓解效果有限，其中对五优308 的缓解效果更好。这可能是因为Ca2++SAR2 处理对NO-3和的吸收高于 SAR2 但仍低于CK，根系生长仍受到抑制，但五优308 根系生长更接近CK 水平。研究表明胞外Ca2+的存在能增加膜厚度，降低细胞膜的流动性，提高H+-ATPase 活性[30]。低强度（pH 4.5）酸雨不改变植物根系质膜稳定性，而高强度（pH 3.0）酸雨降低了根系质膜稳定性[13]。外源Ca2+可能通过调节模拟酸雨下膜稳定性调节H+-ATPase 活性，且对SAR1 和SAR2 处理下膜稳定性的调节和对H+-ATPase活性的调节效果一致。Ca2+与模拟酸雨处理下，外源Ca2+的调控使水稻根中和NO-3含量更接近CK 水平。这与低温胁迫下外源Ca2+缓解小麦生长和氮水平下降的结果一致[31]，表明外源Ca2+有利于缓解非生物胁迫对植物根系生长的抑制。本研究还发现外源Ca2+对SAR1处理下两个品种水稻的调控效果优于SAR2处理，对五优308的调控效果优于南粳9108。ZHANG 等[32]也发现外源Ca2+对盐胁迫下耐受性苦荞的调控效果更好。对比分析外源Ca2+调控作用的共性及差异性，扩大外源Ca2+调控作用的共性，合理利用品种差异性筛选耐受基因并结合外源Ca2+调控作用，将有利于缓解酸雨对农作物生长的抑制，减轻酸雨造成的危害。

恢复期结果显示SAR2 对两个品种水稻NO-3的吸收均造成了不可恢复性伤害，但外源Ca2+减小了SAR2 造成的不可恢复性伤害的程度，更有利于五优308幼苗根系NO-3吸收和根中NO-3含量的恢复。SAR2处理下，由于H+-ATPase 活性和ATP含量受到了不可逆性伤害，导致南粳9108 NO-3和吸收也受到不可逆的伤害。

3.2 外源Ca2+对模拟酸雨下不同抗性水稻根系质膜H+-ATPase磷酸化水平的影响

H+-ATPase 活性受多种方式调控，包括转录水平调控、翻译后修饰调控和信号分子调控。磷酸化是一种翻译后修饰的调控方法，通过14-3-3 蛋白与H+-ATPase C 端自抑制结构结合从而激活H+-ATPase[33]。研究表明胞外H+浓度增加会引发根系质膜H+-ATPase 的磷酸化水平增加[34]，促进 H+-ATPase 活性增加。这与本研究结果中SAR1 导致水稻根系环境酸化，两个品种水稻根系H+-ATPase 磷酸化水平增加引起活性增加相同。SAR2 处理下两个品种水稻H+-ATPase活性均降低，其中南粳9108降幅更大，同时五优308 的H+-ATPase 磷酸化水平没有显著变化，南粳9108 磷酸化水平显著降低。这表明SAR2 处理下，五优308 中的H+-ATPase 磷酸化水平可能不是H+-ATPase 活性降低的主要原因。南粳9108 中H+-ATPase 磷酸化水平的降低是导致其H+-ATPase 活性降低的原因之一。高强度酸雨会降低水稻质膜H+-ATPase 10 个编码基因的转录水平，造成H+-ATPase活性降低[35]。此外，质膜H+-ATPase 作为一种膜结合蛋白，需要磷脂才能发挥活性[36]。笔者先前的研究发现，高强度酸雨会导致水稻根系质膜中总磷脂含量的降低[13]，这可能也是导致H+-ATPase 活性降低的原因之一。南粳9108 中H+-ATPase 磷酸化水平的降低可能是其活性降低的原因之一，同时其转录水平、细胞膜磷脂含量可能均降低，共同引起了南粳9108中H+-ATPase 活性更大程度的降低。研究表明铝胁迫下耐受性强的蚕豆H+-ATPase 磷酸化水平高于敏感性蚕豆[37]，这与本研究中高强度酸雨胁迫下耐受性水稻五优308 中H+-ATPase 磷酸化水平高于敏感性水稻南粳9108的结果一致。

本研究结果显示，Ca2++SAR 处理下外源Ca2+有利于维持水稻根系质膜H+-ATPase 磷酸化水平的稳定，从而保障其活性的稳定。研究表明，Ca2+通过磷酸化影响H+-ATPase 的活性，且这种调节作用并不依赖于钙调蛋白[38]。腺苷5′-单磷酸抑制根系H+-ATPase 磷酸化后会降低植物对铝的耐受能力[39]。而在本研究结果中，外源Ca2+可维持酸雨胁迫下水稻根系H+-ATPase磷酸化水平稳定，这可能是外源Ca2+保障酸雨胁迫下水稻H+-ATPase 活性稳定，提高水稻耐受性的原因之一。此外，本研究也发现酸雨胁迫下，外源Ca2+能缓解酸雨引起的H+-ATPase编码基因转录水平的下降[40]，同时外源Ca2+还能缓解酸雨引起的质膜磷脂含量下降[13]，这可能也是外源Ca2+调控H+-ATPase活性的原因。在研究两个耐盐性差异的水稻品种时也发现，Ca2+增强了耐盐性水稻根系H+-ATPase 磷酸化，而盐敏感性水稻磷酸化水平没有变化[41]。这与本研究中发现外源Ca2+对酸雨胁迫下抗性水稻质膜H+-ATPase 磷酸化水平调控效果更好的结果相似，这可能是外源Ca2+对酸雨胁迫下抗性水稻五优308 的H+-ATPase 活性调控效果更好的原因之一。恢复期，SAR2 处理下五优308 根系质膜H+-ATPase 磷酸化水平恢复至CK 水平，但南粳9108 并未恢复，这与SAR2处理下两个品种水稻根系质膜H+-ATPase 活性的恢复情况一致，因此五优308 根系质膜H+-ATPase 磷酸化水平没有遭受不可逆伤害是其活性可恢复的原因之一。外源Ca2+减小了SAR2 处理对南粳9108 根系质膜H+-ATPase 磷酸化水平的不可逆伤害程度，从而减少了对H+-ATPase活性不可逆伤害程度。

4 结论

（1）pH 4.5 模拟酸雨处理下，五优 308 和南粳9108两个品种水稻H+-ATPase磷酸化水平增加，提高了H+-ATPase 活性，促进了ATP 分解，同时也均促进了对的吸收，然而仅在南粳9108的根中过量积累从而抑制了根系生长，五优308 根中NO-3和含量没有显著变化，根系生长正常。pH 3.0模拟酸雨处理下，南粳9108的磷酸化水平下降导致H+-ATPase活性大幅降低，ATP 水解供能减少，NO-3和吸收及积累减少，根系生长减慢；而五优308 保持了H+-ATPase 磷酸化水平从而避免了H+-ATPase 活性大幅降低，且NO-3、吸收和积累及生长降幅较小。

（2）外源Ca2+能在模拟酸雨（pH 4.5和3.0）处理下保障两个品种水稻根系质膜H+-ATPase 磷酸化水平，有利于维持H+-ATPase 活性稳定，增加ATP 含量，保障H+-ATPase功能稳定，调节NO-3和吸收和积累，缓解根系生长抑制，降低模拟酸雨（pH 3.0）处理造成的不可逆伤害程度。相比于南粳9108，外源Ca2+对五优308的各项指标调控效果更好。