益母草碱通过调节cAMP/PKA信号通路抑制脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡

赵曼云， 郭蔚虹， 张 霞

(海口市120急救中心急救科，海南 海口 570208)

脊髓损伤是临床上常见的高致残率中枢神经系统疾病，当脊髓被直接或间接暴力损伤后会出现组织水肿、血管-脊髓屏障损伤和神经元坏死等现象，使神经再生被抑制，进而使神经系统功能受到破坏[1]。脊髓损伤后的再生修复是当前神经科学领域的研究热点之一，中和或阻断髓鞘组织中的抑制成分或相关信号通路是目前治疗脊髓损伤及促进其修复的主要策略[2-3]。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是细胞内重要的信使，在哺乳动物中枢神经系统干细胞分化和增殖过程中起着重要作用，可以通过激活蛋白激酶A(protein kinaseA，PKA)促进神经再生，且cAMP/PKA信号通路被证明是神经再生、神经重塑的重要调节因子[4-6]。益母草碱是唇形科植物益母草的主要有效成分之一，具有保护心血管、神经系统、肾脏、生殖系统的作用及抗糖尿病等药理用途[7]，并对cAMP/PKA信号通路介导的中枢神经系统功能障碍具有预防和治疗作用[8]，可能通过调节cAMP/PKA信号通路对脊髓损伤后的神经细胞凋亡有一定的抑制作用。因此，本研究探讨益母草碱对脊髓损伤后神经功能的保护作用及可能机制，为相关防治提供新思路和依据。

1 材料

1.1 动物 75只SPF级雄性SD大鼠，6～8周龄，体质量(220±20)g，由海南省疾病预防控制中心提供，实验动物使用许可证号SYXK(琼)2020-0012，常规饲养于安静通风环境下，室内温度20～24 ℃, 相对湿度50%～65%，循环照明12 h/12 h，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 试剂与药物 益母草碱(纯度≥98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，批号190225)。PKA通路抑制剂H-89(美国MedChemExpress公司，批号633210)；caspase-3、环磷酸腺苷(cAMP)ELISA检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、蛋白激酶A(PKAc)、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)、磷酸化的CREB[p-CREB (Ser133)]、脑源性神经营养因子(BDNF)、GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司)；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；TUNEL凋亡试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.3 仪器 电泳仪、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；RT-qPCR仪(美国Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药 75只SD大鼠随机分为假手术组，模型组，益母草碱低、高剂量组，高剂量益母草碱+PKA抑制剂H-89组(益母草碱+H-89组)，每组15只。采用改良Allen’s打击法建立脊髓损伤模型[9]，以T10为中心剃毛，消毒后作手术切口暴露T9-T11棘突，暴露T10对应的脊髓，用20 g击打棍从3 cm高度自由落体撞击T10骨窗对应的脊髓，当大鼠尾巴出现痉挛性摆动、双下肢迅速回缩并挥动，受撞击的脊髓组织水肿、出血，硬脊膜完整呈紫红色的现象时，认为模型制备成功；假手术组仅暴露T10对应的脊髓，不进行打击。造模成功后即开始腹腔注射给药干预，益母草碱低、高剂量组分别注射4、16 mg/kg益母草碱，益母草碱+H-89组在注射16 mg/kg益母草碱的基础上再注射5 mg/kg的H-89，假手术组和模型组注射等量生理盐水，每天1次，连续4周。

2.2 运动功能评价 分别于造模后第7、14、21、28天进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分和斜板角度评估各组大鼠运动功能。BBB运动评分[10]方法为早期以无或极少的后肢关节运动为特征，中期出现几次共济失调步态，晚期表现为拖着脚趾和尾巴、躯干不稳定以及爪子交替轮转。将大鼠后肢运动分为22个等级，后肢全瘫为0分，完全正常为21分，记录2次有效评分，取均值。斜板角度[11]检测方法为，将大鼠头朝左横放在Rivlin斜板上，并从水平位置逐步增大倾斜角度，以大鼠在斜板上停留5 s不掉落为标准，测定斜板角度，获取5次有效角度，取平均值。

2.3 HE染色观察脊髓组织病理学变化 药物干预28 d后，10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的剂量腹腔注射麻醉大鼠后开胸，从左心室插管至主动脉，自心尖灌注生理盐水和4%多聚甲醛固定2 h，取以脊髓损伤点为中心的上下各5 mm节段的脊髓组织，置于4%多聚甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，切片(片厚4 μm)，按照试剂盒说明书进行HE染色，于光镜下观察脊髓组织结构、炎症细胞浸润。

2.4 TUNEL染色检测脊髓组织神经细胞凋亡情况 取“2.3”项下制备的切片，按照TUNEL染色试剂盒说明书进行透化、PBS漂洗、封闭、标记、苏木素复染、脱水、透明、封片等步骤后，于显微镜下观察细胞凋亡情况。每张切片随机取5个视野进行计数统计，凋亡率=[凋亡细胞核数(阳性细胞数)/总细胞核数(总细胞数)]×100%。

2.5 ELISA检测脊髓组织中caspase-3和cAMP水平 取各组大鼠损伤的脊髓组织，加入裂解液冰浴超声匀浆，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，吸取等量上清液和不同浓度的标准品，根据ELISA检测试剂盒说明说进行操作，通过酶标仪检测450 nm波长处各孔光密度(OD450)值，以阴性对照孔调零，根据标准液的检测结果得出标准曲线，计算各组脊髓组织中caspase-3和cAMP水平。

2.6 RT-qPCR检测脊髓组织中PKAc和BDNFmRNA表达 脊髓组织在冰上匀浆器中剪碎，加入TRIzol研磨混匀提取样本总RNA，紫外分光光度计检测各样本总RNA浓度。取2 μg总RNA采用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增。反应条件为95 ℃预变性10 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-△△CT法计算各基因的mRNA相对表达量。PKAc正向引物序列5′-GCTGGCTTTGATTTACGG-3′，反向引物序列5′-GATGTTTCGCTTGAGGATA-3′；BDNF正向引物序列5′-CATCTTAGGAGTGGAAAGGGTG-3′，反向引物序列5′-TATGAAGCCACCTAATCGACCT-3′；β-actin正向引物序列5′-GATGACCCAGATCATGTTTGA-3′，反向引物序列5′-TTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。

2.7 Western blot检测脊髓组织中PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF及凋亡相关蛋白表达 取脊髓组织剪碎匀浆，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法定量后使蛋白变性，取等量蛋白进行凝胶电泳分离并转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，4 ℃孵育稀释后的一抗[cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2、PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF、β-actin，1∶1 000]过夜，次日清洗后加入相应HRP标记的二抗孵育2 h，洗涤后，加入显影液显影成像。使用β-actin抗体进行内参校正，采用Image J软件对条带灰度值进行分析，用目的蛋白与β-actin灰度值比表示目的蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 益母草碱对脊髓损伤大鼠运动功能的影响 如图1所示，除假手术组外，给药7 d时各组大鼠BBB评分和斜板角度无显著性差异(P>0.05)。给药14、21、28 d时，与假手术组比较，模型组大鼠BBB评分和斜板角度降低(P<0.01)；与模型组比较，益母草碱高剂量组BBB评分和斜板角度增加(P<0.01)，益母草碱低剂量组无显著性差异(P>0.05)；与益母草碱高剂量组比较，益母草碱+H-89组BBB评分和斜板角度降低(P<0.01)。给药时间越长，益母草碱高剂量组大鼠后肢功能恢复越好。

3.2 益母草碱对脊髓损伤大鼠脊髓组织病理损伤的影响 如图2所示，假手术组脊髓组织结构完整、致密整齐，细胞结构完好，核大而圆且核仁清晰；模型组和益母草碱低剂量组脊髓组织结构破坏严重，细胞核出现明显固缩，伴有大量炎性细胞浸润；益母草碱高剂量组和益母草碱+H-89组脊髓组织结构紊乱情况有明显改善，炎性细胞浸润减少。

3.3 益母草碱对脊髓损伤大鼠脊髓组织神经细胞凋亡的影响 假手术组、模型组、益母草碱低剂量组、益母草碱高剂量组和益母草碱+H-89组大鼠脊髓组织中caspase-3水平分别为(16.5±1.3)、(66.8±2.0)、(67.0±1.5)、(32.5±1.0)、(48.3±1.2)μg/L。与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织中caspase-3水平升高(P<0.01)；与模型组比较，益母草碱高剂量组大鼠脊髓组织中caspase-3水平降低(P<0.01)，益母草碱低剂量组无显著性差异(P>0.05)；与益母草碱高剂量组比较，益母草碱+H-89组大鼠脊髓组织中caspase-3水平升高(P<0.01)。如图3～4所示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织神经细胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达均升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)；与模型组比较，益母草碱高剂量组大鼠脊髓组织神经细胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达均降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)；与益母草碱高剂量组比较，益母草碱+H-89组大鼠脊髓组织神经细胞凋亡率和cleaved-caspase-3、Bax蛋白表达均升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)。

3.4 益母草碱对脊髓损伤大鼠脊髓组织中PKAc、CREB、p-CREB(Ser133)、BDNF表达及cAMP水平的影响 假手术组、模型组、益母草碱低剂量组、益母草碱高剂量组和益母草碱+H-89组大鼠脊髓组织中cAMP水平分别为(33.2±1.8)、(11.1±0.8)、(11.9±1.2)、(24.2±1.3)、(23.7±0.9)μg/L。与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织中cAMP水平降低(P<0.01)；与模型组比较，益母草碱高剂量组大鼠脊髓组织中cAMP水平升高(P<0.01)，益母草碱低剂量组无显著性差异(P>0.05)；与益母草碱高剂量组比较，益母草碱+H-89组脊髓组织中cAMP水平降低(P<0.01)。如图5所示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表达均降低(P<0.01)；与模型组比较，益母草碱高剂量组大鼠脊髓组织中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表达升高(P<0.01)，益母草碱低剂量组无显著性差异(P>0.05)；与益母草碱高剂量组比较，益母草碱+H-89组脊髓组织中PKAc、p-CREB(Ser133)、BDNF的mRNA和蛋白表达均降低(P<0.01)。

4 讨论

前期研究显示，提高神经元内cAMP/PKA水平或激活该通路信号分子可增强其内在的再生能力，有效地促进脊髓再生[12-15]。益母草碱是从中药益母草中提取的具有显著生物活性的生物碱，在心脑血管病、糖尿病、肾病、生殖等方面有许多新用途[16-17]，但益母草碱对脊髓损伤后的神经细胞是否具有保护作用，尚未有文献报道。

本研究采用改良Allen’s打击法建立脊髓损伤大鼠模型，并连续4周腹腔注射给予不同剂量益母草碱，以探究其对脊髓损伤的作用。研究结果显示，模型大鼠的BBB评分和斜板实验评分均降低，大鼠后肢运动功能受到影响，与前人研究一致[18]，说明模型复制成功。同时，HE病理染色结果显示，模型大鼠脊髓组织出现明显水肿，细胞核明显固缩，伴有大量炎性细胞浸润；给予高剂量益母草碱干预给药后，大鼠脊髓组织水肿和炎性细胞浸润程度明显减轻，后肢运动功能得到明显改善，表明益母草碱对脊髓损伤大鼠有明显的保护作用。

脊髓损伤导致的神经功能永久或长期丧失与脊髓组织的水肿、变性、坏死，以及神经细胞的凋亡是紧密相关[10]。caspase家族蛋白介导细胞凋亡，下调caspase-3在大鼠脊髓损伤神经元中表达，抑制神经细胞凋亡，对损伤后神经组织再生和修复有积极的治疗作用[19]。本研究结果显示，模型大鼠脊髓组织凋亡细胞增多，caspase-3蛋白表达升高；给予高剂量益母草碱干预能抑制模型大鼠神经细胞凋亡，说明它能通过调节脊髓损伤大鼠脊髓组织中凋亡因子的表达抑制细胞凋亡，减轻脊髓损伤程度。

BDNF是一种具有促进神经生长活性的蛋白质，在维持神经元功能、防止神经元退行性变以及神经元损伤后再修复过程中发挥重要的作用。CREB磷酸化后形成的p-CREB可作为调控因子诱导BDNF基因的表达，而PKAc蛋白可通过促进CREB蛋白磷酸化(Ser133)激活，促进靶基因BDNF的转录，进而促进神经细胞存活[20]。本研究结果显示，脊髓损伤大鼠脊髓组织中PKAc、p-CREB(Ser133)和BDNF的mRNA及蛋白表达均降低，说明脊髓损伤后cAMP/PKA信号通路被抑制；高剂量益母草碱干预能够逆转脊髓损伤对cAMP/PKA信号通路的抑制程度，表明它可能是通过激活cAMP/PKA信号通路来抑制神经细胞凋亡、减轻脊髓组织损伤，从而改善大鼠后肢运动功能，促进脊髓损伤的修复。

综上所述，益母草碱能通过激活cAMP/PKA信号通路，减轻脊髓组织病理损伤，减少神经细胞凋亡，促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复。此研究首次探究了益母草碱对脊髓损伤的作用，可为其治疗提供新的潜在药物。