白藜芦醇对PM2.5诱导的血管平滑肌细胞增殖与迁移的影响

吴玉莲， 李昕倡， 李 明， 孙 雪， 罗雨渊， 赵佳仪， 李 岩*

(1.广州中医药大学基础医学院，广东 广州 510006；2.广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006)

动脉粥样硬化是严重影响健康的常见疾病，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)在其中扮演着重要角色，衣原体、氧化低密度脂蛋白等通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、PI3K/Akt、NF-κB等信号通路，促使中膜VSMCs增殖、肥大，最终导致病情发生[1-2]。研究表明，抑制VSMCs增殖和迁移可有效减缓动脉粥样硬化斑块形成，这不仅证实了它在动脉粥样硬化发生发展中的重要作用，也为相关治疗提供了靶点[3-4]。目前发现，益气固本汤、白藜芦醇、红景天等多种中药复方或单体都具有抗VSMCs增殖和迁移作用[5-7]。

PM2.5作为新发现的动脉粥样硬化致病因素，它与该病发生发展的关系已经得到确认[8]。课题组前期发现PM2.5不仅可引起血管内皮细胞凋亡，还能促进VSMCs的增殖和迁移，并且MAPKs家族中的p38 MAPK和JNK参与该过程[9-10]，但中药对PM2.5诱导的VSMCs增殖和迁移的影响尚不明确。因此，本实验建立PM2.5染毒的VSMCs模型，采用白藜芦醇进行干预，观察该成分对VSMCs增殖和迁移的影响，并探讨其作用机制，以期寻找防治PM2.5心血管毒性的新方法。

1 材料

1.1 细胞株 VSMCs购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司，用含10%FBS的DMEM完全培养基于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 试剂 白藜芦醇(纯度≥99%，货号R5010-100MG, 美国Sigma-Aldrich公司)，参考Gueguen等[11]报道的方法，用DMSO配制成40 mmol/L贮存液，置于-20 ℃冰箱中避光保存，实验时取适量加入完全培养基中稀释至所需终浓度。PM2.5(货号SRM1649b，美国Sigma-Aldrich公司)，用培养基配制为50 mg/mL贮存液，置于-20 ℃冰箱中保存，实验时先混匀，再取适量加入完全培养基中稀释至所需终浓度。CCK-8试剂盒(货号JE603)购自日本同仁化学研究所；MAPK抗体(货号A10832)、Phospho-p38 MAPK抗体(货号AP0297)、JNK抗体(货号9258T)、Phospho-JNK抗体(货号4668S)、GAPDH抗体(货号AC033)、HRP标记的二抗均购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液(货号P0013B)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号P0012S)、ECL显色试剂盒(货号P0018S)均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 仪器 MCO-175型CO2培养箱(日本Sanyo公司)；H1850R型高速冷冻离心机(湖南长沙湘仪检测设备有限公司)；680型酶标仪、1645050型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tanon 5200型全自动化学发光图像分析系统(上海天能科技有限公司)；MS800共聚焦显微镜(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 分组及给药 将细胞随机分为对照组、PM2.5组、白藜芦醇组，其中PM2.5组根据课题组前期报道，终质量浓度采用12.5 μg/mL PM2.5染毒[9]；白藜芦醇组先用不同终浓度(5、10、20 μmol/L)白藜芦醇预处理24 h，再用12.5 μg/mL PM2.5染毒；对照组、PM2.5组培养基中分别含有与白藜芦醇组(20 μmol/L)相同浓度的DMSO，以排除溶剂可能造成的影响。根据检测要求，在染毒后不同时间收集样品进行后续操作。

2.2 CCK-8法检测VSMCs增殖率 取100 μL细胞悬液(含5×103个细胞)接种于96孔板内，按“2.1”项下方法分组及给药，每组6个复孔，另设空白孔调零。培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液100 μL，孵育4 h后用酶标仪在450 nm波长处测定光密度(OD)值，计算细胞增殖率。

2.3 EdU法检测VSMCs增殖能力 取1 mL细胞悬液(含1×105个细胞)接种于24孔板内预置的载玻片上，待细胞贴壁后按“2.1”项下方法分组及给药，每组3个复孔，培养24 h后，更换为含50 μmol/L EdU的培养基继续孵育3 h，再按说明书进行固定和染色，最后用Hoechst 33342标记细胞。在共聚焦显微镜下随机选取5个视野进行采样，计算EdU染色阳性细胞率。

2.4 划痕实验观察VSMCs迁移能力 取1 mL细胞悬液(含5×105个细胞)接种于6孔板中，培养24 h后用100 μL枪头垂直在培养板中划线，PBS清洗脱落的细胞，按“2.1”项下方法分组及给药，每组3个复孔。于染毒0、24 h对细胞进行观察并拍照，测量划痕面积，计算划痕愈合率。

2.5 Transwell法检测VSMCs迁移能力 取200 μL细胞悬液(含1×104个细胞)加入Transwell小室上室，下室加入含15% FBS的DMEM培养基500 μL，按“2.1”项下方法分组及给药，每组3个复孔，培养24 h后取出上室，PBS清洗3次，多聚甲醛固定20 min，风干后用0.1%结晶紫染色30 min。在显微镜下随机选取5个视野拍照计数穿膜细胞数，以实验组与对照组穿膜细胞数的比值代表细胞迁移能力。

2.6 Western blot法检测p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化表达 取1 mL细胞悬液(含5×105个细胞)接种于6孔板内，贴壁后按“2.1”项下方法分组及给药，每组3个复孔。根据课题组前期结果，在染毒20 min后收集细胞，RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度[9]。取15 μg变性蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，常规转膜，BSA封闭，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜后TBST洗涤3次，再用二抗(1∶5 000)孵育2 h，最后加入ECL发光液曝光、拍照。采用Image J软件对结果进行灰度值分析，计算磷酸化蛋白与总蛋白的比值。

3 结果

3.1 白藜芦醇对PM2.5诱导的VSMCs细胞增殖的影响 图1A显示，与对照组比较，PM2.5组可促进VSMCs增殖(P<0.05)；与PM2.5组比较，不同浓度白藜芦醇组均可抑制PM2.5诱导的VSMCs增殖(P<0.05)。图1B～1C显示，与PM2.5组比较，白藜芦醇组EdU染色阳性细胞数目减少，比例降低(P<0.05)，白藜芦醇浓度为20 μmol/L时抑制效果最强。

3.2 白藜芦醇对PM2.5诱导的VSMCs细胞迁移的影响 图2A显示，与对照组比较，PM2.5组细胞划痕愈合率升高(P<0.05)；与PM2.5组比较，白藜芦醇组细胞划痕愈合率降低(P<0.05)。图2B显示，与对照组比较，PM2.5组穿膜细胞数增加(P<0.05)；与PM2.5组比较，白藜芦醇组穿膜细胞数减少(P<0.05)。

3.3 白藜芦醇对PM2.5诱导的VSMCs细胞p38 MAPK、JNK蛋白磷酸化表达的影响 图3显示，与对照组比较，PM2.5组细胞p38 MAPK、JNK蛋白磷酸化表达升高(P<0.05)；与PM2.5组比较，白藜芦醇组细胞p38 MAPK、JNK蛋白磷酸化表达降低(P<0.05)。

4 讨论

VSMCs主要存在于血管壁中膜,生理状态下其增殖和凋亡处于动态平衡,病理情况下其发生增殖、肥大并向内皮下迁移,同时分泌细胞外基质，参与动脉粥样硬化斑块形成[1]。在动脉粥样硬化斑块内VSMCs来源的细胞占70%左右，因此VSMCs的增殖和迁移在动脉粥样硬化发病中占重要地位[12]。多种动脉粥样硬化致病因子均可影响VSMCs，本实验室和其他研究者都证实大气污染物中的PM2.5致动脉粥样硬化作用也与影响VSMCs的增殖和迁移有关，并认为p38 MAPK和JNK途径参加介导了该过程[9-10,13]。

中药具有多靶点、多层次等优势，在干预VSMCs方面具有独特的优势，多种中药复方或有效成分被证实具有抗VSMCs增殖和迁移作用[14-15]。研究显示白藜芦醇可通过影响氧化应激、炎症反应等多种途径，抑制Ox-LDL、血管紧张素Ⅱ等动脉粥样硬化致病因子诱导的VSMCs细胞增殖和迁移[7,15-17]。然而白藜芦醇对PM2.5染毒VSMCs细胞的影响并不清楚。本研究结果显示，白藜芦醇干预后VSMCs细胞增殖能力、细胞迁移能力均下降，表明白藜芦醇可抑制PM2.5诱导的VSMCs细胞增殖和迁移。

p38 MAPK和JNK均属于MAPKs家族成员，是多种细胞增殖、分化、凋亡的重要调节通路[18-19]。以往研究发现，PM2.5染毒会使VSMCs细胞的p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化表达升高，并且相应的抑制剂可以抑制VSMCs细胞增殖和迁移，证明p38 MAPK和JNK参与介导PM2.5对VSMCs的毒性[9]。本研究结果显示，白藜芦醇干预后细胞p38 MAPK和JNK蛋白磷酸化表达降低，提示白藜芦醇的作用效果与抑制二者磷酸化表达有关。其他研究者发现大蒜素、川穹嗪等中药有效成分也可以通过影响p38 MAPK等MAPKs家族蛋白来抑制PM2.5引起的VSMCs增殖[10]。

综上所述，白藜芦醇可能通过降低p38 MAPK和JNK磷酸化表达来抑制PM2.5诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移，有望为进一步利用白藜芦醇防治PM2.5诱导的心血管毒性提供了实验基础。