基于网络药理学探讨金砂行气胶囊抗慢性浅表性胃炎的作用机制

张 营， 干国平,2*， 杨桂平， 杨德森,2 ， 余 亮， 陈 倩

(1.湖北中医药大学药学院，湖北 武汉 430065；2.湖北省中药炮制工程技术研究中心，湖北 武汉 430065；3.孝感市中医医院，湖北 孝感 432000)

慢性浅表性胃炎属于慢性胃炎的范畴，是指胃黏膜在各种致病因素作用下所发生的非萎缩性慢性炎症性病变，约90%胃炎患者属于该类型[1-3]，患者常表现为反复或持续性上腹不适、饱胀、反酸、嗳气等，本病是慢性胃炎发展的最初阶段，如继续加重，有发展为慢性萎缩性胃炎甚至癌变的可能[4-5]。目前认为，慢性浅表性胃炎的发病多与幽门螺杆菌感染、十二指肠液反流、免疫等因素相关[6-7]，西医治疗手段包括根除幽门螺杆菌、抑酸、保护胃黏膜等，虽有一定疗效，但存在容易复发、过敏等问题。

大量研究表明，中医药在治疗慢性胃炎方面具有一定的优势。慢性浅表性胃炎属中医“胃痛”“痞满”范畴，其病变部位均在胃[8]，胃黏膜受损，胃失和降而致痞满、升降失常、气机不畅而表现为胀满不适、胃痛，应从脾胃论治。金砂行气胶囊是孝感市中医医院研制的纯中药制剂，主要作用于慢性浅表性胃炎、反流性胃炎、十二指肠球炎等，具有和胃降逆、理气止痛、消积导滞等功效。为了探究金砂行气胶囊治疗慢性浅表性胃炎的药理作用及其机制，本研究借助网络药理学来揭示该制剂作用机制，为后续研究提供新的思路及方向。

1 材料

1.1 动物 清洁级SD大鼠，体质量160～180 g，雌雄各半，购于湖北省三峡大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(鄂)2017-0012。

1.2 试剂与药物 金砂行气胶囊(组方药材柴胡、郁金、青皮、香附、黄连、法半夏、鸡内金、砂仁、焦山楂、降香、莱菔子)由孝感市中医医院提供。气滞胃痛颗粒(批号20191226)，购自辽宁华润本溪三药有限公司；阿莫西林胶囊(批号200644)，购自海南通用三洋药业有限公司；克拉霉素胶囊(批号2001008)，购自江苏亚邦爱普森药业有限公司；奥美拉唑肠溶胶囊(批号JA2004001)，购自浙江金华康恩贝生物制药有限公司；胶体果胶铋剂胶囊(批号20191103)，购自山西振东安特生物制药有限公司。羧甲基纤维素钠(批号20120330)、氨水(批号20200529)，购自国药集团化学试剂有限公司；4%多聚甲醛(批号HT202201)，购自武汉塞维尔生物科技有限公司。PierceTM Rapid Gold BCA 蛋白测试盒、TNF-α试剂盒、 IL-6 ELISA 试剂盒(货号E-BC-K318-M、E-EL-R2856c、E-EL-R27842c)，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；5×蛋白上样缓冲液，购自四维加生物科技(武汉)有限公司；Tris缓冲液，购自德国BioFroxx公司。

1.3 仪器 RM2235石蜡切片机(德国Leica公司)；IX70光学显微镜(日本Olympus公司)；高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher公司)；多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 模型建立 60只大鼠随机分为正常组8只、造模组52只，造模组大鼠每天自由饮用0.05%氨水，同时配合饥饱失常复制慢性浅表性胃炎模型。造模80 d后，随机抽取2组大鼠进行胃组织病理学检测，根据慢性浅表性胃炎胃组织的病理改变判定模型是否建立成功[9-10]。

2.2 分组及给药 称取胶囊内容物适量，溶于1% CMC-Na中，超声溶解30 min，即得药液。将大鼠随机分为正常组，模型组，金砂行气胶囊低、中、高剂量组(187.5、375、750 mg/kg)，气滞胃痛颗粒组(782 mg/kg)，四联疗法组(阿莫西林、克拉霉素、奥美拉唑肠、胶体果胶铋联合用药，剂量分别为20.82、5.21、0.42、2.08 mg/kg)，每组8只，给药组大鼠每天灌胃给予相应药物，正常组、模型组大鼠灌胃给予等体积1% CMC-Na混悬液，连续给药30 d。

2.3 取材 取材前夜大鼠禁食不禁水，当天(给药第30天)称定体质量后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.1 mL/kg)麻醉，采用一次性采血针腹主动脉采血于真空采血管中，血样室温静置60 min后4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱中保存。大鼠取血后处死，迅速取胃组织，沿胃大弯侧切开，生理盐水冲洗后滤纸吸干，切取部分胃组织，置于4%多聚甲醛中固定，其余放入消毒处理过的冻存管中，立即置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色观察大鼠胃组织病理变化 将已固定的大鼠胃组织采用石蜡包埋法制片，HE染色后在高倍显微镜下观察，拍照记录病理切片的形态变化。

2.5 ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-6水平 酶标仪读取光密度(OD)值，根据标准曲线计算TNF-α、IL-6水平。

2.6 Western blot法检测大鼠胃组织中p-IκBα、p-Akt1蛋白表达 取大鼠胃组织适量，加入组织蛋白提取试剂，在冰浴中匀浆裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清，即得总蛋白样本。蛋白样本加入5×蛋白上样缓冲溶液，100 ℃水浴煮沸10 min进行变性处理，经电泳、转膜后，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗置于摇床上，在4 ℃下孵育过夜，次日TBST洗膜，加入二抗置于摇床上，在4 ℃下孵育1 h，滴加ECL发光液进行显影。采用Odyssey成像系统进行扫膜，通过Odyssey v2.0软件进行分析。

2.7 金砂行气胶囊成分和靶点数据库的构建 应用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件，得到金砂行气胶囊的活性成分，并检索其活性成分的作用靶点，Uniprot(https：//www.uniprot.org/)数据库对检索到的药物靶点进行基因名校正。以“chronic superficial gastritis”为关键词，在OMIM(https://www.omim.org/)和Genecards(https：//www.genecards.org/)数据库中检索与慢性浅表性胃炎相关的靶点，删除重复靶点。于Venny2.1在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)上分别录入金砂行气胶囊和慢性浅表性胃炎的靶点，绘制韦恩图，得到两者交集，作为潜在作用靶点，最后上传至在线STRING软件，设置参数为>0.9，最后输出PPI蛋白互作网络图，获取蛋白互作信息。

2.8 金砂行气胶囊成分靶点交互作用和机制研究 采用Cytoscape3.6.1软件，构建金砂行气胶囊“成分-靶点-疾病”交互作用网络图，“Network Analysis”功能进行网络拓扑分析，依据度值筛选分析关键化合物。通过DAVID数据库对交集作用靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析，预测金砂行气胶囊作用于慢性浅表性胃炎的分子作用机制。

3 结果

3.1 药理作用研究

3.1.1 模型评价 在第30～80天，造模组大鼠体质量增长缓慢，同一时间点低于正常组(P<0.05,P<0.01)，见表1。正常组大鼠胃组织黏膜腺管排列整齐，大小形状一致，腺体排列紧密整齐；造模组大鼠在80 d时，胃黏膜层炎性细胞浸润，程度以中重度为主，胃腺管紊乱或疏密不均，黏膜层呈充血性水肿等炎性损伤表现，见图1。依照我国慢性胃炎病理诊断标准(2006，上海)和悉尼直观模拟评分法，评定模型建立成功。

表1 造模期间大鼠体质量变化

3.1.2 金砂行气胶囊对慢性浅表性胃炎大鼠体质量的影响 如表2所示，与模型组比较，给药15 d后，金砂行气胶囊低、中剂量组大鼠体质量有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，金砂行气胶囊高剂量组、四联疗法组大鼠体质量均增加(P<0.05)；给药30 d后，金砂行气胶囊中、高剂量组大鼠体质量有较大幅度增长，但差异仍无统计学意义(P>0.05)。

3.1.3 金砂行气胶囊对慢性浅表性胃炎大鼠胃组织病理学变化的影响 如图2所示，正常组大鼠胃黏膜腺管排列整齐，大小形状一致，腺体排列紧密整齐，壁细胞、主细胞界限清楚，固有层内未见炎性细胞浸润，黏膜下层无或稍轻微水肿；模型组大鼠胃腺管紊乱或疏密不均，黏膜层呈充血性水肿，可见上皮细胞坏死脱落，黏膜下层水肿，程度以中、轻度为主；金砂行气胶囊给药30 d后，大鼠胃黏膜固有层炎性细胞数目减少，胃腺排列稍整齐平整且腺管构造逐渐规则，接近正常组。由此表明，金砂行气胶囊对慢性浅表性胃炎的胃组织病理改变有显著抑制作用。

表2 各组大鼠体质量变化

3.1.4 金砂行气胶囊对慢性浅表性胃炎大鼠血清TNF-α、IL-6水平的影响 如图3所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6水平升高(P<0.01)；与模型组比较，四联疗法组和金砂行气胶囊各剂量组大鼠血清TNF-α水平均降低(P<0.05，P<0.01)，气滞胃痛颗粒组、四联疗法组和金砂行气胶囊高、中剂量组大鼠血清IL-6水平均降低(P<0.05，P<0.01)。

3.1.5 金砂行气胶囊对慢性浅表性胃炎大鼠胃组织p-IκBα、p-Akt1蛋白表达的影响 如图4所示，与正常组比较，模型组大鼠胃组织p-IκBα、p-Akt1蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，气滞胃痛颗粒组和金砂行气胶囊中、高剂量组大鼠胃组织p-IκBα蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，气滞胃痛颗粒组、四联疗法组和金砂行气胶囊中、高剂量组大鼠胃组织p-Akt1蛋白表达降低(P<0.05)。

3.2 网络药理学研究

3.2.1 成分和靶点的筛选 在TCMSP数据库中，分别检索砂仁、半夏、黄连、柴胡、降香等11味中药，删除无作用靶点和重复的化合物，共有123个，对应2 071个靶点，删除重复靶点，最终得到457个。以“慢性浅表性胃炎”为关键词进行检索，在OMIM和Genecards数据库中搜索相关靶点，合并删除重复靶点，最终得到疾病靶点730个。将上述2种靶点进行交集，发现有126个靶点重合，见图5。

3.2.2 核心靶点蛋白相互作用网络构建 将126个共同作用靶点导入STRING数据库中，绘制相关靶点PPI网络图，见图6，设置置信度为0.9并隐藏断开单独靶点，PPI图中有90个节点，447条边，平均节点度9.93，PPI的富集显著性P<1.0×10-16。节点代表药物治疗慢性浅表性胃炎的作用靶点，边代表靶点与靶点之间有相互作用，表明这些靶点在某些方面是相互关联，协同配合起到治疗疾病的作用。导出含节点信息的TSV文件，在Cytoscape中分析节点信息，筛选出前20个核心调控基因靶点，见表3。

表3 金砂行气胶囊关键靶点基因的拓扑学分析

3.2.3 “成分-靶点-疾病”网络图构建 采用Cytoscape 3.6.1软件，构建“成分-靶点-疾病”相互作用网络，见图7，图中红色圆形代表金砂行气胶囊中活性成分，绿色三角形代表蛋白靶点。再进行网络拓扑属性分析，依据度值大小筛选得到排名前15的潜在重要活性成分，分别为槲皮素、山柰酚、木犀草素、熊果酸、金丝桃苷、β-谷甾醇、右旋巴马汀、维斯体素、刺芒柄花素、柚皮素、异鼠李素、川陈皮素、豆甾醇、美迪紫檀素、卡维丁。

3.2.4 生物过程与通路分析 生物过程分析主要涉及药物反应、老化基因的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、NF-κB转录因子活性的正调控及凋亡过程的正向调控等；在细胞组成和分子功能方面，主要集中在细胞胞外间隙、胞浆和线粒体外膜中，并涉及酶结合、蛋白质结合、细胞因子活性、蛋白激酶活性等，见图8A。对126个关键靶点进行KEGG信号通路分析，共得到165条信号通路(P<0.05)，选取排名前二十的绘制气泡图，进行可视化分析，见图8B，可知共同靶点主要富集于癌症通路、肿瘤坏死因子、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等。

4 讨论

本研究通过网络药理学方法，得到药物-疾病共同靶点126个，金砂行气胶囊可作用于多个靶点，靶点之间也存在着复杂的相互作用关系，并且富集于多条炎症相关的信号通路，体现了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点。富集分析显示核心靶点主要作用TNF、TP53、Akt1、MAPK等通路上，提示这些蛋白是金砂行气胶囊作用于炎症通路的主要分子。其中IL-6的表达与炎症反应程度、幽门螺旋杆菌相关胃肠病发展风险相关，不仅可以引起炎症细胞的集中，还能刺激更多炎症介质的产生[11-12]。MAPK8作为一种激酶，当机体发生炎症反应时，能够诱导细胞发生凋亡，同时促进炎症因子TNF-α、IL-1β的活化，加重慢性浅表性胃炎的炎症损伤[13-14]。caspase3与慢性浅表性胃炎的发病关系密切，该基因低表达导致的细胞凋亡异常降低可能是胃癌的发病机制之一[15]。TNF-α是促进幽门螺旋杆菌感染、抑制胃酸分泌的关键性炎症因子[16]，其能够诱导NF-κB结合雄激素受体启动子，激活炎症信号通路，使IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子水平升高，结合富集分析推测TNF信号通路的激活是慢性浅表性胃炎发生发展的重要因素，调控TNF信号通路可抑制幽门螺旋杆菌感染[17-18]，从而控制该病的进展，可能成为该病新的治疗方向。

综上所述，金砂行气胶囊可有效改善慢性浅表性胃炎模型大鼠症状。网络药理学表明金砂行气胶囊是通过多成分、多靶点、多通路协同发挥抗慢性浅表性胃炎药理作用，为进一步分子作用机制研究提供了理论依据。