干细胞在心血管疾病治疗中的应用研究

张海峰 韦 植

(1 中山大学孙逸仙纪念医院心血管内科，广东省广州市 510080；2 中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院心胸外科，广西南宁市 530021)

近年来我国心血管疾病的患病率持续上升，《中国心血管健康与疾病报告2020》[1]数据显示，2020年我国心血管疾病现患病人数约3.3亿，居各类疾病之首。心血管疾病可造成心肌细胞缺血坏死、坏死区域瘢痕组织修复、心肌收缩功能下降、心律失常，最终导致患者出现心力衰竭而死亡。目前，心肌缺血的主要治疗方法有药物治疗、冠状动脉介入或搭桥手术、心脏辅助装置、心房分流、终末期的心脏移植等，前5种方法可在一定程度上延缓心力衰竭的进展，但不能使死亡心肌再生，而目前心脏移植的供体仍严重匮乏且费用高，手术要求和条件高，难以普及。干细胞在特定诱导条件下可定向分化成有收缩功能的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，将其移植至缺血坏死的心肌区域，可通过肌电耦连和旁分泌作用，使心肌收缩增强、血管再生、心肌再生，从而改善心功能，因此干细胞一直是生物医学研究的热点之一。目前，治疗心血管疾病的干细胞主要有诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、心脏干细胞(cardiac stem cell，CSC)和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)。其中，ESC为同种异体干细胞，其主要来源于早期发育的胚胎，但由于其存在伦理和免疫排斥等问题，限制了其在临床上的应用。本文就iPSC、MSC和CSC在心血管疾病治疗方面的优点和局限性进行总结，旨在为干细胞在心血管疾病治疗中的应用提供参考。

1 iPSC

iPSC是自体成熟体细胞经过重编程后获得的具有自我更新和多能分化能力的一种细胞。2006年，Takahashi等[2]将转录因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4转染到小鼠的成纤维细胞中，首次获得了类似ESC的多能干细胞。次年，该团队对人皮肤成纤维细胞进行重编程，获得了具有细胞再生及分化能力的细胞，这是首个诱导出的人源iPSC[3]。iPSC来源广泛，且其不存在伦理和免疫排斥等方面的问题，因此极利于研究及临床试验的开展。但因c-Myc这一常见原癌基因的加入和病毒的参与，iPSC在分化过程中有向肿瘤细胞分化的风险，且定向分化成心肌细胞的效率也比较低。因此，关于iPSC的主要研究方向是如何改进重编程技术，使其在诱导过程中去肿瘤细胞化，提高其向心脏祖细胞分化的纯度，以及采用何种培养分化方法提高其分化成心肌细胞的数量、移植区的富集。2009年，Yu等[4]通过新的编程方法，去除病毒载体和原癌基因 c-Myc而获得iPSC，解决了病毒载体和原癌基因 c-Myc导致癌变的难题。目前，制备iPSC的主要方法有细胞核移植、转录因子诱导及化学重编程。化学重编程具有操作简便、时空调控性强、作用可逆、细胞重编程过程高度可控等优点。另外，小分子诱导体细胞重编程技术规避了传统转基因操作引发的安全问题，使其应用于临床的可能性大大增加。促进iPSC分化成心肌细胞的方法有拟胚体生成法、与内脏内胚层样细胞共培养、2D单层培养法、3D悬浮培养法等。其中3D悬浮培养法能产生大量心肌细胞，且生产成本低、效率相对较高。2014年，一例年龄相关性黄斑变性患者接受了iPSC衍生细胞移植，移植后第1年，该患者没有出现畸胎瘤形成等移植后的免疫排斥迹象，且视力得到相应改善[5]，该方法的安全性和有效性由此得到了初步认可。动物实验结果显示，把iPSC注入大鼠的缺血心肌区域，iPSC可分化为血管内皮细胞、心肌细胞和平滑肌细胞，并且可以增加心脏射血分数、减少纤维化[6-7]。另有研究结果显示，通过心肌内的微球移植术将iPSC衍生的心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞整合到猪的缺血心肌内，可以提高左室射血分数，改善心肌代谢及减少梗死面积[8]。移植定向分化的心肌干细胞不仅可与周围正常心肌细胞建立电生理整合、增加心肌细胞收缩功能，还能分泌血管内皮生长因子、血管紧张素-1、血管紧张素-2、成纤维细胞生长因子-2、趋化因子-1、白细胞介素-1β、白细胞介素-10、血小板衍化生长因子、肝细胞生长因子、基质细胞衍生因子-1、胰岛素样生长因子-1、胸腺素-β4、Wnt5a和促红细胞生成素等因子营养心肌，改善心脏的收缩功能[9]。2015 年，Menasché等[10]将人ESC来源的心肌祖细胞移植到晚期缺血性心力衰竭患者的心脏中，结果未见肿瘤生成，患者的心功能获得改善。这使得iPSC在心血管疾病治疗中的应用前景更加广阔。但不管采用何种编程方法，一次编程所产生的iPSC的效率仍较低，其定向分化成心肌细胞的数量尚少，且其潜在的致瘤风险尚不能完全排除，这限制了iPSC在临床上的广泛应用。如何攻克这一难点，将是今后重点研究的方向。值得注意的是，2018年日本批准了一项将iPSC衍生的心肌样细胞用于治疗心脏病的临床试验[11]，该研究主要观察iPSC衍生的心肌样细胞治疗心脏病的安全性及其对心功能恢复情况的影响。这是该细胞首次被批准用于治疗心脏病的临床研究，研究的结果将会引起全球的广泛关注。

2 MSC

MSC是非终末分化细胞的一种，主要存在于骨髓、脂肪组织、脐带血和胎盘等多种组织中，其主要表达典型标志物如CD146、CD90、CD105、CD73等，具有极强的多向分化潜能和自我更新能力。在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞等，连续传代培养和冷冻保存后其仍具有多向分化潜能[12]。研究显示，不论是自体还是同种异源的MSC，一般都不会引起宿主免疫反应，因此其应用较为广泛。通过富含多种生长因子培养基的定向诱导，可以使MSC分化成不同类型的心肌细胞用于心脏的修复[13]。临床中，用于治疗心血管疾病的MSC主要来自骨髓和脂肪组织，取材容易，来源方便。MSC主要通过以下几种机制治疗缺血性心血管疾病：(1)通过MSC刺激心脏细胞的增殖和分化，以及血管的生成。有研究人员在猪的心肌缺血模型中验证了MSC可以刺激心脏细胞的增殖和分化这一结论，同时还发现MSC可以分化成心肌细胞和血管，并且具有调节心肌细胞生长发育的功能[14]。(2)通过分泌生长因子及旁分泌作用促进心脏修复，减少心肌细胞凋亡。MSC可以促进外泌体和细胞外囊泡以可溶性形式分泌、释放出多种细胞因子和生长因子。Zhang等[15]将MSC分泌的细胞因子、生长因子与CSC共培养，发现其可增强血管内皮细胞的分化能力，促进血管新生，减少纤维化，这提示含有这些细胞因子、生长因子的外泌体是MSC的关键活性成分。此外，通过旁分泌机制也可刺激内源性心脏祖细胞释放血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1等因子，使其向心肌缺血区迁移和增殖，进而分化成心肌细胞，增强心肌功能[16]。有研究表明，MSC可释放出富含miR-22的外泌体，这些外泌体进入心肌细胞内与甲基CpG结合蛋白2 (Mecp2) 相互作用，可阻止心肌细胞凋亡[17]。(3)免疫调节。Krampera等[18]研究发现MSC能够抑制梗死心肌细胞发生炎症反应，减少炎症细胞与炎症因子对心肌造成的急性损伤。Luger等[19]发现，在心肌缺血再灌注时，静脉输注MSC能抑制自然杀伤细胞与中性粒细胞的活性，缓解左心室功能减弱和逆转心肌重塑。在动物模型中，将同种异体的骨髓 MSC 注入心肌梗死后的绵羊冠状动脉内，可使其左心室射血分数增加，并使心肌梗死面积减少约40%[20]。免疫组化分析和心脏核磁成像结果显示，在异位心脏移植大鼠术后48 h静脉注射骨髓 MSC，治疗28 d后可观察到大鼠移植心脏的心功能增强、心肌纤维化减少、心肌细胞凋亡受到抑制，此外该法还可以促进心室重构和新血管生成[21]。多种动物模型实验都表明MSC治疗缺血性心脏病可获得良好的效果。例如，2004年Chen等[22]将69例发病12 h内的急性ST段抬高型心肌梗死患者随机分成两组，予冠状动脉分别注射自体骨髓MSC和生理盐水，随访6个月显示干细胞治疗组患者的心肌功能较对照组改善。骨髓MSC治疗急性心肌梗死的多中心随机临床试验[23]结果显示，经冠状动脉移植骨髓MSC治疗急性心肌梗死可提高患者的心肌血流灌注和左室射血分数，且治疗的可行性和安全性均较高，未见发生相关的室性心律失常或其他主要不良心脏事件。为了更大规模地评估MSC在临床应用中的安全性和有效性，2018年Lalu等[24]对MSC治疗心肌缺血的23个临床研究(包含1 148例患者)进行了一项荟萃分析，结果显示，MSC治疗急性心肌梗死和缺血性心力衰竭整体上是安全有效的，能改善心脏功能，缩小心肌梗死面积，明显降低心肌梗死复发率和死亡率，虽然部分患者输注MSC后可引起短暂性发热，但无治疗相关的急性毒性反应、感染、肿瘤形成，无致死性心律失常发生。此后大规模的临床试验进一步展开，如NCT01652209、NCT03404063等，截至2021年6月，在美国国立卫生研究院的临床试验注册网站(clinicaltrials.gov)上有关MSC治疗缺血性心脏病的临床项目达到56项，且近几年来该类研究项目不断呈现增多的趋势，显示出巨大的应用潜力和前景。目前，已有用于治疗心脏病的MSC产品在美国、韩国、欧盟国家等获批使用，我国也有多款MSC产品获准进行临床试验研究。

3 CSC

成体心脏曾一度被认为是终末分化器官，心肌梗死后不能再生。2003年，Beltrami等[25]在《Cell》杂志发表一项研究成果，其认为成体心脏中存在着一群能在体内分化为心肌细胞的c-Kit+细胞(即心肌干细胞)，其将c-Kit+细胞分离后在体外进行培养、富集后注射到坏死心肌细胞区域，20 d后发现移植c-Kit+细胞分化产生的心肌细胞可以修复大部分坏死区域、改善心脏收缩功能，由此认为心脏内存在内源性干细胞。该研究成果发布后在学术界引起巨大反响，随后陆续有研究发现不同表面标志的CSC，包括胚胎抗原-1+CSC、干细胞抗原-1+CSC、胰岛素增强子结合蛋白-1+CSC、侧群细胞、心肌球源性细胞和心肌球细胞、心外膜源性细胞，但各种CSC分布的位置和比例均不相同[26-29]，且动物实验研究表明CSC具有心肌细胞和血管的结构特性[30]。自体CSC可从心耳、心室、心外膜活检中获得，在移植前将CSC进行体外培养、增殖[31]，可得到大量的CSC，足以进行心肌干细胞移植，且其对心肌收缩功能的改善作用显著，因此，CSC移植治疗心肌缺血具有广阔的应用前景。但在2004年，Murry等[32]采用类似的细胞谱系追踪实验技术进行实验，未发现骨髓来源的c-Kit+细胞在体内可分化为心肌细胞，而只能分化为血细胞。2012年Jesty等[33]采用相同方法并不能重复Beltrami等[25]关于c-Kit+心肌干细胞在成年梗死的心肌中可转化为心肌细胞的研究结果。2014年van Berlo等[34]在《Nature》上发文质疑Beltrami等[25]声称的心肌干细胞在治疗心肌梗死中的作用，该研究发现心肌干细胞治疗心肌梗死的效果非常有限，其不能在梗死的患者中产生足够量的心肌细胞。2018年，经哈佛大学等相关部门调查后认定[35]，Beltrami等[25]研究者涉嫌捏造数据和论文造假，最终其发表的34篇论文被相关杂志撤销，这使得CSC治疗心血管疾病的临床试验基本停滞。但在一些临床试验如SCIPIO试验[28]、CADUCEUS试验[29]中发现，冠状动脉内注射内源性CSC，能提高心肌缺血患者的左室射血分数，缩小心肌梗死面积和瘢痕组织，增强心脏局部收缩功能，患者的生活质量获得提高。这可能与以下原因有关：不同表面标志的CSC虽不能分化成心肌细胞，但其旁分泌作用可以促进心脏内源性干细胞的迁移、增殖、分化和血管形成，还可以促进内源性CSC的募集，抑制梗死区细胞的凋亡，抗心肌重塑，从而改善心脏功能[36-39]。由于成体心肌细胞中仍存在非常缓慢的细胞分裂能力，在心肌缺血出现后，如何提升其分裂成心肌细胞的能力，代替坏死心肌细胞发挥作用，改善心功能，或将是今后研究的热点。

4 小结与展望

心力衰竭是心血管疾病患者死亡的主要原因，干细胞移植不仅能提供新生的心肌细胞，还可通过分泌各种营养心肌的因子来改善心功能，是治疗急性心肌梗死、心脏缺血再灌注损伤、缺血性心脏病的理想选择。由于ESC存在伦理和免疫排斥等问题，导致其在临床上的应用受到限制。而iPSC具有类似ESC的特性，能分化形成大量心肌细胞，但由于其存在诱发肿瘤的风险，因此需要在重编程技术方面作进一步研究，以达到在移植前将其定向分化为心肌细胞的目的。MSC具有免疫调节特性且来源方便，还可以进行同种异体移植，目前其在临床试验中的应用已经取得一定的成果，应用前景十分广阔，但仍面临移植存活力低、体外培养时间越长移植后细胞的归巢率越低等问题。内源性CSC能否分化为心肌细胞目前未能得到公认，且其疗效尚存疑，而成体心肌细胞仍有细胞分裂能力，但其数量少，分裂效率低下，如何提高其分裂能力或是今后研究的方向之一。在临床实践中，干细胞治疗的时机、细胞数量、疗程、输注方式、如何提高靶区富集等仍是需要解决的问题。不同技术的联合应用应是今后临床治疗心血管疾病的主要方向，例如通过生物材料为干细胞提供生物性能和结构上的支持，以促进干细胞的定植、生长和分化，从而提高细胞的移植率[40]；将干细胞与ESC来源的外泌体共培养，然后移植到心肌缺血处以促进干细胞存活和增殖，提高其分化成心肌细胞与血管内皮细胞的能力，以改善心肌收缩功能[41]。此外，选择何种给药方式来避免肺部对干细胞的清除，如何一次取得足够量的原代细胞以减少干细胞体外培养的时间，让干细胞更好地保持其干性，从而更好地发挥其疗效也是今后研究的重点，需要进行大量的临床实践。